鑽石舞台

基因編輯技術能夠讓人類對特定DNA片段進行敲除或加入,目前最流行的就是CRISPR/Cas9技術

01 外源DNA俘獲

CRISPR/Cas系統在這一步實現了一個識別功能。序CRISPR/Cas系統將識別出入侵者的「名字」（PAM）並找到它的原間隔序，然後把間隔序列記錄到CRISPR序列中。

當噬菌體病毒首次入侵宿主細菌，病毒的雙鏈DNA被注入細胞內部。CRISPR/Cas系統會從這段外源DNA中截取一段序列作為外源DNA的序列，然後將其作為新的間隔序列被整合到基因組的CRISPR序列之中。

因此，這段與間隔序列對應的「外源序列」被稱為原間隔序列（protospacer）。然而，外源序列的選取並不是隨機的。原間隔序列向兩端延伸的幾個鹼基都十分保守，被稱為原間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。

PAM通常由NGG三個鹼基構成（N為任意鹼基）。病毒入侵時，Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描這段外源DNA，並識別出PAM區域，然後將臨近PAM的DNA序列作為候選的原間隔序列。

隨後，Cas1/2蛋白複合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來，並在其他酶的協助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導區的下游。然後，DNA會進行修復，將打開的雙鏈缺口閉合。這樣一來，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中

02 crRNA合成

CRISPR/Cas系統共有三種方式（Type Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。CRISPR/Cas9系統屬於Type Ⅱ，是目前最成熟也是應用最廣的類型。因此，本次分享將重點介紹CRISPR/Cas9的原理。

當外源DNA進入，CRISPR序列會在前導區的調控下轉錄出：pre-CRISPR-derived RNA (pre-crRNA)和trans-acting crRNA（tracrRNA）。其中，tracrRNA是由重複序列區轉錄而成的具有發卡結構的RNA，而pre-crRNA是由整個CRISPR序列轉錄而成的大型RNA分子。隨後，pre-crRNA，tracrRNA以及Cas9編碼的蛋白將會組裝成一個小型「兵工廠」。

它將根據外源DNA的類型，選取對應間隔序列RNA，並在RNase Ⅲ的協助下對這段序列進行剪切，最終形成一段短小的crRNA（包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重複序列區）。

03 靶向干擾

Cas9/tracrRNA/crRNA這個複合物將掃描整個外源DNA序列，並識別出與crRNA互補的原間隔序列。這時，複合物將定位到PAM/原間隔序列的區域，DNA雙鏈將被解開，形成R-Loop。

crRNA將與互補鏈雜交，而另一條鏈則保持游離狀態。隨後，Cas9蛋白發起猛烈攻勢，其HNH酶活性將剪切crRNA互補的DNA鏈，而其RuvC活性位點將剪切非互補鏈。最終，Cas9使雙鏈斷裂（DSB）形成，最終使得外源DNA的表達被沉默

04 靶向機制

05 細節注意

01 特異性切割位點的確認

設計目的：

CRISPRi:破壞基因蛋白編碼能力，利用非同源末端鏈接容易出錯的性質，對特定基因進行敲除或敲低

CRISPRa:插入表位，熒光標記，或引入特定突變，依賴於同源重組時通過外源性模板來修復斷裂DNA

設計原則：

1：設計在外顯子上，在基因上游越靠前越好

2：長度大約在20nt，潛在靶位點是[5『-20NT-NGG]

3：後面或者前面是PAM序列

4：sgRNA種子序列儘量避免以4個以上的T結尾，GC%含量最佳為40%~60%

5：構建U6或T7啟動子驅動sgRNA的表達載體，考慮sgRNA的5' 鹼基為G或GG，以提高其轉錄效率

02 sgRNA設計工具

1:http://crispr.mit.edu/ - MIT在線CRISPR工具（張峰實驗室）

2: http://www.e-crisp.org/E-CRISP/- 目前最好的在線工具

3:http://crispr.u-psud.fr/- 簡單高效的在線工具，支持靶位點分析

4:http://zifit.partners.org/ZiFiT/ - 簡單高效

5:http://www.biootools.com/col.jsp?id=103 適用於sgRNA/cas9系統， 綜合適用的CRISPR工具

6: http://www.rgenome.net/cas-offinder/- 適用於基因組，支持其他Cas蛋白系統

03 sgRNA設計實例

網址：http://crispr.mit.edu/ - MIT

所有結果可以以Excel的格式下載，選擇綜合得分高且位於外顯子越近越上游的序列

註：可以直接獲得PCR擴增的引物序列

04 sgRNA活性驗證

SSA活性檢測：

當CRISPR-Cas9能對靶序列進行有效切割形成DNA雙鏈斷裂，細胞通過SSA機制對DNA序列進行同源重組修復，重新形成有活性的熒光素酶基因，通過熒光檢測就可以預測CRISPR-Cas9的切割活性。

錯配內切酶檢測法：

靶序列經CAS/sgRNA切割後由於缺乏修復模板 ，或多或少會插入或刪除一些鹼基。因此將靶序列PCR擴增後經變性、退火，將形成錯配。錯配酶（主要是CEL1或T7E1酶）將識別錯配的雜合雙鏈並剪切。產物跑電泳，比較切割條帶與未切割條帶的比例，即可反映出Cas/sgRNA的活性

體外切割活性檢測：

01 CRISPR/dCas9干擾基因表達

在T細胞中引入PD-1 sgRNA / Cas9 ， T7E1酶確認成功編輯PD-1基因組

02 CRISPR/dCas9干擾基因表達通過Cas9-sgRNA質粒破壞mdr1

T7E1切割試驗檢測靶基因的破壞

03 CRISPR/Cas9靶向去甲基化激活Gene表達

dCas9靶向去除SARI的甲基化區域，以激活內源性SARI的mRNA表達水平

04 CRISPR/Cas9激活Gene表達

sgRNA將（d）Cas9與反式激活因子融合導向PTEN近端啟動子進而激活PTEN表達