化學與材料科學 - 山東大學卞小瑩教授/張友明教授團隊 Angew: 兩種β-羥基化氨基酸的不同生物合成機制－鑽石舞台

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非核糖體肽(NRPs)是一類結構多樣，生物活性廣泛的天然產物，包含D型氨基酸，羥基化氨基酸和非蛋白質氨基酸等多種非天然氨基酸。羥基化氨基酸是由羥化酶催化形成的一類重要的手性模塊化合物，β-羥基化天冬氨酸（β-OHAsp）廣泛分布於天然產物中，尤其是鐵載體類化合物，而β-羥基化組氨酸（β-OHHis）在天然產物中比較罕見。此外，Asp羥化酶和His羥化酶的催化機制至今未知，僅停留在生物信息學預測階段。

近日，山東大學卞小瑩教授和山東大學/中科院深圳先進院張友明教授團隊，以基因組挖掘發現的新型非核糖體脂肽Glidomides為研究對象，通過生物信息學分析，體內原位敲除和大量的體外酶學相結合的策略，闡明了Asp羥化酶和His羥化酶的催化形成羥基化氨基酸的不同機制。首次確定了非核糖體肽合成酶中Interface結構域（I domain）的功能，通過保守位點E54和D166負責招募羥化酶GlmF，從而行使催化功能。

研究結果

（1）Glidomides（1-4）是由Schlegelella brevitaleaDSM 7029產生的一類新型脂肽，包含一個罕見的羥基化組氨酸（threo-β-OH-L-His），羥基化天冬氨酸（threo-β-OH-D-Asp）及3-氨基吡咯烷-2-酮（S-Apo）。基因簇包含兩個雙加氧酶基因glmD和glmF，四個非核糖體合成酶（NRPS）核心基因及其他附屬基因。

圖1.Glidomides的生物合成基因簇示意圖及結構。(a) glm生物合成基因簇示意圖；(b) HPLC-MS分析不同突變株的甲醇粗提物；(c) Glidomides的化學結構。

（2）threo-β-OH-D-Asp的生物合成：縮合結構域（Cdomain）影響模塊3中腺苷化結構域（Adomain）對不同底物的識別能力；GlmD催化NRPS模塊3中的CA3T3E蛋白結合的最佳底物L-Asp發生反應，產生β-OH-L-Asp，與終產物1中β-OH-D-Asp相比構型發生了異構。異構化結構域（E domain）處於該基因簇的中部，因此推測E結構域的真正催化底物是硫醇化結構域（T domain）綁定的肽酰，而不是T綁定的氨酰。T綁定的肽酰在體內發生異構化後，經多步模塊反應形成終產物1。因此證明了GlmD催化Asp羥基化，且先於異構化。

圖2.A3結構域對底物的識別及LC-MS分析GlmD的體外酶學催化反應。(a) 通過焦磷酸鹽釋放方法檢測A3結構域對底物的識別；(b) LC-MS分析GlmD的體外酶學催化反應；(c) GlmD催化天冬氨酸羥基化的示意圖。

（3）threo-β-OH-L-His的生物合成：I結構域對A1結構域對底物專一性識別影響不大。GlmF催化NRPS模塊1中IA1T1蛋白結合的底物L-His發生反應，產生β-OH-L-His，而A1T1蛋白則不產。為進一步驗證該結果，負責脂肪酸鏈加載的GlmE蛋白分別與其進行反應，結果顯示實驗組均可以產生目標產物8和9，但A1T1蛋白組中的產量較IA1T1蛋白組的產量降低了90%。這一結果表明，I結構域在GlmF催化組氨酸羥基化的形成過程中起着重要作用。

圖3.A1結構域對底物的識別及LC-MS分析GlmF的體外酶學催化反應。(a) 通過焦磷酸鹽釋放方法檢測A1結構域對底物的識別；(b) LC-MS分析GlmF的體外酶學催化反應；(c) LC-MS分析GlmF和GlmE的體外酶學催化反應；(d) GlmF催化組氨酸羥基化的示意圖。

（4）IA1T1蛋白與羥化酶GlmF的互作研究：I結構域是縮合結構域的一個新分支，僅包含保守位點Asp，而缺少了保守的催化位點His。I結構域呈V字型，由N端亞結構域和C端亞結構域構成。作者發現R18，R19和R310三個位點阻斷了底物結合口袋，保守位點R344的缺失使得T結構域無傳遞底物的結合位點。因此I結構域不能結合底物且不具有催化活性。突變結果顯示，I結構域的突變體E54和D166與GlmF的互作條帶消失，且E54和D166致使終產物1和2及體外目標產物8的產量降低。E54和D166在空間位置很近且氨基酸側鏈均朝外，因此I結構域是通過保守位點E54和D166介導與GlmF的相互作用。與催化游離氨基酸底物的羥化酶相比，GlmF在結構上呈現一個特殊的entrance helix，推測其在羥基化氨基酸形成過程中與T結構域負責的底物呈遞存在相關性。基於以上結果，首次提出組氨酸羥基化產生機制：A1結構域識別L-His，遞送形成T1-L-His；I結構域通過E54和D166招募羥化酶GlmF；T1結構域將底物遞送至GlmF的底物結合口袋，發生羥基化後，T1結構域進一步將羥基化底物遞送至GlmE的C結構域催化口袋，與脂肪酸鏈發生縮合。

圖4.IA1T1與羥化酶GlmF的互作研究及組氨酸羥基化形成機制。(a) IA1T1突變體的體外活性檢測；(b) IA1T1突變體的體內活性檢測；(c) I結構域蛋白的結構；(d) IA1T1突變體與GlmF的相互作用分析；（e）和（f）羥化酶GlmF和GlmD與游離氨基酸底物的羥化酶的結構比對；（g）和（h）組氨酸羥基化發生機制。

（5）S-Apo的生物合成：硫酯酶結構域（TE domain）通過水解或環化方式從裝配線上釋放天然產物。體內和體外結果表明，S-Apo可由T結構域綁定的氨基酸底物Dab自發的親核攻擊而形成，無需酶催化。但與此同時，根據體內外相應產物產量的比較，作者推測在Glidomide合成裝配過程中TE可能保護或維持T結構域綁定的氨基酸底物Dab不發生環化，待T綁定正確的肽酰產物時，TE可能促進Dab的自由氨基攻擊羰基而形成Apo，並釋放終產物。

本研究不僅為β-羥基化非天然氨基酸的生物合成提供了研究思路，而且在重新設計並改造NRPS獲得更多新型天然產物方面具有指導意義。

原文鏈接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202203591

作者簡介

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卞小瑩教授主要從事微生物基因組編輯技術、天然產物與合成生物學研究。自加入山東大學微生物技術國家重點實驗室以來，逐漸形成了「從使能技術開發加速基因簇挖掘，到生物合成機制解析，再到結構改造」的研究特色。近五年已在Nat Commun（2篇）、PNAS、Nucleic Acids Res、Angew Chem Int Ed（2篇）、ACS Catalysis等期刊上發表通訊作者論文30餘篇。

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