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今天給大家帶來一篇研究端粒調節蛋白與癌症相關性的文章，文章發表在Briefings in Bioinformatics（IF：11.622）上。該研究利用生物信息學的方法，在零實驗的情況下，通過對shelterin在各種癌症中的表達、突變以及與免疫通路的關係，系統性的研究了shelterin作為靶點以及作為癌症標誌物的可能性。

研究背景

端粒是染色體末端的高度有序結構，在癌症的發生和發展中至關重要。端粒被一種稱為shelterin的特殊蛋白質複合物所屏蔽。shelterin複合物由名為TRF1、TRF2、RAP1、TPP1、POT1和TIN2的六種蛋白質組成，可防止端粒降解或融合[8–11]。在這個複合物中，TRF1和TRF2是雙鏈端粒DNA結合因子，而POT1直接與單鏈DNA結合。TIN2和TPP1橋接TRF1、TRF2和POT1以穩定複合物。RAP1通過與TRF2相互作用被招募到端粒。

腫瘤細胞的免疫逃逸是腫瘤發生的重要機制。有趣的是，shelterin被發現通過其額外的端粒功能調節晚期癌症免疫。然而，在癌症中保護素調節的詳細機制仍然是難以捉摸的。在本文中，研究者調查了33種TCGA癌症類型的9125名患者中shelterin的基因組、表觀基因組和轉錄組學情況，揭示了shelterin複合物在癌症中的調節作用和臨床結果的相關性。

研究結果

1、shelterin在癌症中表達和突變情況

研究方法與結論：

1）為了研究癌症中shelterin組分的基因組特徵，首先計算了33種癌症類型中9125名泛癌隊列患者的體細胞拷貝數改變（SCNA）和突變頻率。shelterin基因的總體DNA改變水平介於2%到7%之間。雖然DNA改變頻率相對較低，但15%的腫瘤至少包含一種類型的改變（圖1B）。

2）通過分析33種癌症類型的改變模式，觀察到一些癌症類型比其他癌症類型表現出更多的改變（圖1C）。

3）TRF1擴增主要發生在LIHC（14.5%）、PRAD（16.5%）和三種泛婦科癌症中：BRCA（11.3%）、OV（16.4%）和UCS（12.5%）（圖1D）。

4）兩種生殖器官（OV和PRAD）的TRF2、RAP1和TPP1共缺失比例相對較高（兩種癌症類型均>5%，P<0.001）（圖1E）。TRF2、RAP1和TPP1的共缺失或共擴增與TRF1擴增具有相互排斥的模式（圖1E）。

圖1

研究結論：在不同的癌症背景下，擴增和缺失主要改變shelterin的表達，而基因突變影響除shelterin在腫瘤發生中的表達以外的其他功能。

2、shelterin的基因表達分析揭示了三個患者群和不同癌症表達水平

研究方法與結論：

1）在TCGA數據庫中，獲得了19種癌症類型。通過檢測腫瘤和正常樣本之間的差異表達，發現shelterin在這些癌症類型中表現出異質性表達模式（圖2A）。

2）對33種癌症類型的所有腫瘤樣本的mRNA表達進行無監督一致聚類，出現了三個不同的樣本簇，其中簇A顯示了所有六個shelterin基因的最高表達（圖2B和C）。

3）通過檢查三個簇中癌症類型的分布，我們發現DLBC、三種神經相關癌症（GBM、LGG、PCPG）和胸腺主要位於簇A中，而COAD、KICH、LIHC、LUAD、READ在該簇中幾乎耗盡。BRCA和OV主要分布在B群中。SARC、SKCM、THCA、UCS幾乎均勻分布在三個群中（圖2D）。

4）使用了一系列分數來衡量基因組不穩定性的特徵，發現具有最高shelterin表達的簇A在所有這些基因組不穩定性得分中表現出最低水平（圖2E-I）。

圖2

研究結論：shelterin的表達譜以癌症類型依賴的方式失調。

3、shelterin相關的生物途徑和免疫信號

研究方法與結論：

1）為了探索shelterin相關途徑，對shelterin的表達和每種癌症類型中所有蛋白質編碼基因的表達進行相關性分析。證實了shelterin是細胞生長和細胞周期的重要調節因子這一事實（圖3A和B）。

2）為了更好地了解shelterin與腫瘤免疫之間的分子聯繫，計算了shelterin評分與免疫治療中至關重要的一組免疫調節劑之間的相關性。shelterin評分與各種癌症中的免疫調節劑具有不同的相關性（圖3C）。

3）在兩項關於晚期黑色素瘤和轉移性尿路上皮癌的數據集中，shelterin在治療前與PD1呈中度正相關（圖3D）。Shelterin與晚期黑色素瘤的不良反應相關，而與轉移性尿路上皮癌的良好反應相關（圖3E）。

圖3

4、DNA甲基化、miRNAs和lncRNAs調節shelterin的表達

研究方法與結論：

1）為了評估DNA甲基化水平和shelterin mRNA表達之間的關係，對每種癌症類型的六種成分進行了spearman相關分析。在大多數癌症中，TRF2、RAP1、TPP1、POT1的DNA甲基化水平與其mRNA表達呈負相關，而TRF1的DNA甲基化水平則呈正相關（圖4A）。

2）大量的miRNA靶向至少兩個shelterin成員，形成了一個相互作用網絡（圖2B）。由於p53途徑與shelterin呈負相關（圖3B），研究者推斷p53可能通過miRNA調節shelterin。

3）檢測p53、shelterin和miRNA之間的串擾，發現p53調控的miRNA的一個子集可以靶向shelterin成員TRF1、TRF2、TPP1、POT1和TIN2（圖4C）。

圖4

5、Shelterin預測患者生存率

研究方法與結論：

1）在33種癌症類型中，shelterin與24種癌症的總生存率顯著相關（圖5A和B）。在ACC、GBM、KICH、LGG、MESO、OV、PAAD、SKCM和胸腺中，觀察到shelterin是一種有利的生存因子（圖5A），而在BLCA、BRCA、COAD、ESCA、HNSC、KIRC、KIRP、LAML、LIHC、PCPG、PRAD、READ、THCA、STAD和UVM中，shelterin與較差的生存率相關（圖5B）。

2）為了進一步探討shelterin與生存率的關係，對所有六個單獨的shelterin基因和綜合shelterin評分進行了cox回歸分析（圖5C）。該分析的結果是，RAP1具有最多的相關癌症類型，其中9種為陽性。POT1被發現是LAML、LGG、READ和SKCM的不良預後因素。特別是對於LGG，六個shelterin基因中的五個和shelterin評分都可以預測更好的存活率。

圖5

研究結論：shelterin可以預測某些癌症患者的生存率。

6、分析識別潛在的靶向shelterin信號的化合物

研究方法與結論：Connective map 分析確定了潛在的靶向shelterin的化合物。通過在 33 種癌症類型中設置至少 10 種與 shelterin 相關的嚴格臨界值，發現18種化合物正相關（圖6A），23種化合物負相關（圖6B）。在這些化合物中，發現六種蛋白質合成抑制劑與shelterin呈正相關，這意味着抑制蛋白質合成可能誘導shelterin表達（圖6A）。相比之下，CDK、PLK和mTOR抑制劑是負性調節shelterin的潛在化合物（圖6B）。

圖6

研究結論

本文的研究調查了33種TCGA癌症類型的9125名患者中shelterin的基因組、表觀基因組和轉錄組學情況。對多個層面的數據進行了全面的數據分析：包括體細胞拷貝數改變（SCNA）、點突變、mRNA表達、DNA甲基化、miRNA表達、lncRNA調節、免疫特徵、患者生存率和相關化學物。本文對shelterin的綜合分析為理解shelterin生物學提供了豐富的資源，確定了shelterin在治療癌症中的潛在作用。

全文鏈接：https://academic.oup.com/bib/article-abstract/22/5/bbaa441/6120315?redirectedFrom=fulltext

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整合空間轉錄組和單細胞測序揭示PDAC組織結構

單細胞RNA測序（scRNA-seq）能夠系統地識別組織中的細胞群，但描述其空間組織仍然具有挑戰性。2020年發表在Nature Biotechnology（IF=54.901）上的文章Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas，結合了基於微陣列的空間轉錄組（ST）方法，利用一系列spots揭示基因表達的空間模式。開發了Multimodal intersection analysis (MIA)多模式交叉分析，對原發性胰腺腫瘤應用發現導管細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和癌細胞的亞群具有空間限制。此外，還識別出表達應激反應基因模塊的炎症性成纖維細胞和癌細胞的共定位。

結果一：用 scRNA-seq 識別 PDAC 中的細胞群

首先收集了兩個未經治療的PDAC患者的新鮮原發腫瘤，用於平行scRNA-seq和ST分析。scRNA-seq 數據每個細胞具有大約 2500 到 3300 個UMI 和大約 1400 到 1700 個唯一表達的基因。分別確定了PDAC-A和PDAC-B腫瘤中的15種和11種不同的種群，共享的細胞類型的基因表達特徵顯示患者樣本之間具有很強的相關性，驗證了對樣本群集的注釋。基於scRNA-seq的拷貝數變異（CNV）分析區分PDAC癌細胞和非惡性導管細胞。對於每個已識別的細胞類型推斷染色體擴增和缺失，並檢測到 PDAC-A 中的兩個cluster和 PDAC-B 中的一個cluster顯示異常 CNV。兩個PDAC-A癌症cluster-1和cluster-2表現出TM4SF1（cluster-1）或S100A4（cluster-2）的高表達，而PDAC-B癌症集群在TM4SF1表達中高，表明PDAC-A cluster-1和PDAC-B癌症群的相似性。為了進一步驗證 scRNA-seq 數據中識別的TM4SF1和S100A4表達種群是否代表癌細胞群，在源自同一患者的組織石蠟切片上對 TM4SF1 和 S100A4 進行了雙重免疫熒光染色進一步驗證了這一現象。

圖1 兩個PDAC腫瘤的scRNA-seq分析

結果二：PDAC 組織空間轉錄組

組織切片及H&E染色揭示了PDAC的四個主要區域：癌細胞粘連區、非惡性導管上皮區、基質區域和胰腺腺泡區，其中PDAC-B的患者組織不包含正常的胰腺腺泡區。然後對樣本進行空間轉錄組測序，使用芯片特定位置的barcode對序列進行解碼，識別每個轉錄本在組織內的空間定位。使用 H&E 染色圖像估計每個 ST spot捕獲了大約 20-70 個細胞、約2400個UMI和大約1000個唯一基因。對所有ST spot中表達變異程度最高的基因進行主成分分析（PCA），根據主成分對每個ST陣列的spot進行聚類後，發現所生成的cluster與獨立的組織學注釋一致，支撐了僅根據ST基因表達在一個切片內識別不同空間區域的能力。

結果三：多模式交叉分析 （MIA）

為了集成 scRNA-seq 和 ST 數據集，作者開發了 多模式交叉分析Multimodal intersection analysis (MIA)。首先劃定細胞類型特定和組織區域特定基因集，然後確定它們的重疊程度，相比於隨機數值判斷其重疊程度是否顯著富集。在 scRNA-seq 數據中識別每個細胞類型來定義基因集，相比於其他細胞類型這些基因的表達該細胞類型中具有較高的統計學水平，隨後識別出每個空間區域的表達率明顯高於其他區域的基因。通過超幾何檢驗，評估在 scRNA-seq 和 ST 模式中提取的基因集是否顯著重疊，進而將空間信息與轉錄組信息聯合起來進行其他分析。

圖2 PDAC的ST和細胞類型的映射

結果四：識別和映射跨組織區域細胞亞群

scRNA-seq 最有用的方面之一是它能夠揭示細胞類型中不同的亞群。因此，作者試圖通過識別細胞類型中的亞群，然後應用 MIA 來查詢整個組織空間的映射來描述細胞群體內部的異質性。基於scRNA-seq發現兩個腫瘤樣本中大多數細胞由KRT19+導管細胞組成，這是胰腺外分泌系統的兩種主要成分細胞類型之一。作者總共確定了四個導管細胞亞群：（1）表達APOL1和缺氧相關基因的導管細胞亞群；（2）表達TFF1、TFF2和TFF3的終端導管亞群；（3）表達CRISP3和CFTR的中心亞群；（4）表達MHC-II類分子和補體通路成分的抗原呈遞導管細胞。雖然MHC-II類分子主要表現在抗原呈遞細胞（B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞）的表面，但肝臟、胃腸道和呼吸道的上皮細胞表達MHC-II類分子。由於它們存在於腫瘤中，這些抗原呈遞導管細胞很可能通過促進T細胞活化，在調節腫瘤微環境內的炎症反應方面發揮作用。這四種亞群中，第1類和第4類是先前的單細胞測序沒有報道過的，作者通雙重免疫熒光實驗驗證了亞群的存在。

與細胞類型分析一樣，作者使用每個導管亞群特有的標記基因，使用 MIA 確定這些導管亞群在組織切片中的富集情況。作者發現PDAC-A患者中的所有導管亞群都富集在組織的導管區域。相比之下，只有缺氧和晚期導管細胞群在癌症區域顯著豐富。這些導管細胞所展示的轉錄表型可能反映來自周圍組織的環境信號，例如由於含氧量低，癌區導管細胞可能表達缺氧反應相關基因。相比之下，PDAC-B 中的導管亞群都完全富集於導管上皮區域。

圖3 跨組織區域的導管細胞亞群的MIA映射

結果五：整合分析不同癌症人群PDAC組織

在PDAC-A scRNA-seq數據中發現了兩個癌細胞群，這些數據在基因和轉錄上似乎都截然不同。雖然作者發現這兩種癌症種群在相應的ST癌症區域中都富含，但它們是否與該地區內不同的細胞類型同位？為了探索PDAC-A患者兩個癌症種群是否在相同切片區域共定位的問題，作者對該患者進行了額外的組織切片，確保 scRNA-seq 數據代表所有 ST 部分：腫瘤切片先分為三個部分，然後每個部分被分在 ST 和 scRNA-seq 之間。通過比較PDAC-A新增的區域，作者確定了各自PDAC-A樣本區域特有的基因列表之間的重疊，發現整個ST數據集的癌症和基質區域之間有顯著重疊。對於每個組織部分中癌症豐富的區域，使用分層聚類進一步將癌症豐富的區域劃分為轉錄組相關的分區。在定義了每個子區域特有的基因集後，再次應用 MIA 映射方法來研究與子區域相關的基因集、每個細胞類型定義的基因集和 scRNA-seq 數據中的子群之間的重疊，進一步定義了細胞類型/亞群與組織空間之間的關聯性。

圖4 細胞亞群的空間分布情況

結果六：解析腫瘤微環境下的細胞狀態關係

最近對癌細胞scRNA-seq數據的研究表明，在膠質母細胞瘤、黑色素瘤、頭頸癌等多種癌症類型中，細胞狀態是獨一無二的。由於ST提供空間信息，是否可以繪製癌細胞狀態到不同的空間組織區域，並描述它們與其他細胞類型的相互作用。為此，作者生成了第三個PDAC scRNA-seq數據集並定義PDAC癌細胞中的三個基因表達模塊。根據每個模塊的基因，注釋這些作為缺氧反應，氧化磷酸化和應激響應模塊。作者發現單核細胞和T/NK細胞在應激反應模塊區域大量富集。綜合分析TCGA PDAC數據，結果表明涉及炎症性成纖維細胞和表達應激基因模塊的癌細胞之間的關係，並驗證了MIA方法對於生成細胞群與空間受限結構的關係的效能。

圖5 使用MIA繪製癌細胞狀態與細胞亞型之間的關係圖

小結：

作者對於單細胞測序和空間轉錄組信息進行了整合分析，開發了MIA分析方法，系統揭示了胰腺導管腺癌的空間組織結構，為我們提供了良好的整合分析思路。

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