近日，凱萊英醫藥集團（股票代碼：002821.SZ/6821.HK，以下簡稱「凱萊英」）在美國化學會學術期刊《Org. Process Res. Dev.》上刊發論文《設計用於高效合成Rimegepant關鍵中間體的轉氨酶》（Engineering a Transaminase for Efficient Synthesis of Rimegepant Key Intermediate）。生物合成技術研發中心（CBST）酶進化團隊採用新穎的酶改造策略，實現了酶活性從無到有、從有到優的大幅度升級，首次實現了通過生物酶催化合成治療偏頭痛藥物Rimegepant的關鍵中間體，具有里程碑式的意義。該項研究結果由凱萊英獨立完成，是凱萊英在工程酶領域取得的又一突破性進展，彰顯了公司在該領域的卓越實力和領先地位。
降鈣素基因相關肽（CGRP）是治療和預防偏頭痛最有前途的靶點之一，CGRP是由37個氨基酸組成的神經肽，是神經源性炎症的介質之一。CGRP類藥物整體市場預計可從2019年的6.39億美元增加到2026年的62.95億美元，有望成為偏頭疼治療領域增長的主要推動力。Rimegepant是一款口服CGRP受體拮抗劑，在2020年2月獲得FDA批准用於治療急性偏頭痛，顯示出良好的安全性和有效性。
目前，Rimegepant關鍵手性中間體1的生產過程涉及過渡金屬催化劑催化的兩步高壓還原氨化反應，（圖1）。反應中使用的金屬催化劑成本高昂，且兩步反應收率僅有55%。
圖1.化合物1的生產路徑
轉氨酶一步催化酮的轉氨反應生成相應的手性胺，是目前製藥工業中應用廣泛的製備方法。
圖2.化合2的酶胺化反應
凱萊英生物合成技術研發中心（CBST）在此領域深耕多年，建立了種類豐富的轉氨酶酶庫，可針對不同類型的底物進行快而準的高通量篩選，已經成功完成了數十個轉氨酶的篩選以及工業應用案例。研究人員首先以化合物2為底物對超過300個轉氨酶進行了篩選（圖 2），然而沒有篩選到有明顯活性的酶。這個結果並不出人意料，化合物2在其潛手性羰基的兩側緊鄰兩個空間位阻都比較大的芳香基團，由於轉氨酶自身的結構特點，這類分子很難被轉氨酶轉化是一個普遍的共識。另外，儘管定向進化是提高酶效率的常用手段，對於沒有初始活性酶的改造仍然是一個巨大的挑戰。
面對這樣的挑戰，凱萊英研究團隊首先使用了「substrate walking」的策略（圖3），利用空間位阻較小的底物類似物作為底物，以使轉氨酶的活性向所需目標底物方向進化。正如研究團隊預期，在經過兩輪進化之後，成功獲得了對目標底物有0.02%轉化的突變體，實現了酶活性的「從無到有」，打開了「從0到1」的局面。
圖3.以化合物4為底物的「Substrate walking」
鑑於轉氨酶結合口袋附近的「柔性」loop在底物識別和酶活性中起着關鍵作用，研究人員通過對獲得的突變體三維結構進行分析，在底物通道位置識別出一段關鍵的「柔性」loop區（圖4）。通過對組成這段loop的氨基酸殘基進行迭代飽和突變（ISM, iterative saturation mutagenesis）, 獲得了一個活性提高450倍的突變體。之後，為了進一步提高酶活，研究人員採用了定向進化的策略，構建了大量的高質量文庫，並利用凱萊英的高通量篩選平台對文庫進行篩選，得到1個活性提高近50000倍的突變體，實現了酶活「從有到優」的飛躍式升級。
圖4.83-91 loop的位置
研究人員使用最優突變體，對反應條件進行了優化，其中反應溫度的影響較大，將反應溫度由60℃降至45℃，最終轉化率也由92%提高至99%以上。隨後，研究人員進行了公斤級的放大，並建立了高效的反應後處理工藝，最終產品的分離收率達到80.2%，de值99.5%、純度99.9%。顯示出了酶法合成Rimegepant關鍵中間體的工業應用潛力。
圖5.反應溫度優化
凱萊英生物合成技術研發中心（CBST）團隊通過酶進化獲得可以高效合成Rimegepant關鍵中間體的轉氨酶突變體，並利用酶法工藝實現了Rimegepant關鍵手性中間體的公斤級製備。與現有工藝相比，新的酶法工藝大幅提高了收率，避免了貴金屬催化劑的使用，降低了有機溶劑的使用，反應可以在常溫常壓下進行，降低了生產成本和三廢排放，更加安全環保。此項成果再次彰顯了凱萊英在酶工程領域的技術實力和規模化應用水平。
長期以來，凱萊英作為全球範圍內工程酶開發及商業化應用領域的領先者，持續深耕綠色製藥技術，不斷提升研發與規模化放大生產平台的能力和效率，強化服務客戶的能力。生物合成技術研發中心（CBST）擁有專業的研發和生產團隊，並搭建起先進成熟的酶篩選、進化平台。迄今已為全球眾多客戶提供從酶庫篩選、酶進化、酶的發酵再到產業化生產的全方位服務，成功實現了許多重要藥物原料關鍵中間體的酶催化生產，在相應領域擁有多項自主創新技術。
未來，凱萊英將不懈開發和推廣先進的綠色可持續性酶法解決方案，為客戶創造更大價值。讓酶工程等先進綠色製藥技術走出實驗室，應用於規模化生產之中，創造價值、造福患者。
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