鑽石舞台

RNA甲基化（m6A）數據分析與課題設計精講班【4月23日-24日】

背景

N6-甲基腺苷 (m6A)作為哺乳動物信使RNA中最普遍的內部修飾，通過調控靶RNA的命運在正常的生物過程和發育中發揮重要作用，其調控異常與包括癌症在內的多種疾病有關。儘管由METTL3和METTL14組成的m6A甲基轉移酶複合物被認為是主要的m6A寫入者，但METTL3和METTL14的耗竭導致某些細胞類型的m6A修飾僅減少約60%，並且纖維素中的大部分m6A標記與METTL3和METTL14的結合位點不匹配。這些觀察結果表明存在其他m6A甲基轉移酶。人類甲基轉移酶樣蛋白 (METTL)屬於一個由30多個成員組成的超家族，具有保守的S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)結合位點。然而，大部分METTL蛋白的功能和相關分子機制尚不清楚。METTL16最近被鑑定為m6A甲基轉移酶，但據報道，它僅將m6A添加到幾個非編碼RNAs U6小核RNA、MALAT1和XIST以及一個mRNA靶標 (MAT2A)中。儘管有一項研究報告了METTL16在小鼠胚胎發育中的作用，但尚未研究其在正常發育和疾病 (例如，癌症)中的生物學功能。

簡介

2022年2月10日，來自美國貝克曼研究所的Rui Su及其團隊在Nat Cell Biol(IF: 20.042)雜誌上發表名為METTL16 exerts an m6A-independent function to facilitate translation and tumorigenesis的研究[1]。

主要結果

METTL16 將 m6A 沉積到一小部分 METTL16 結合的 mRNA 轉錄物中。在對兩個獨立的大規模全基因組聚集的規則間隔短回文重複序列 (CRISPR) CRISPR 相關蛋白 9 (Cas9) 敲除 (KO) 篩選數據集的分析中，我們發現，在 METTL 家族成員中，METTL16 是絕大多數癌細胞存活的最重要的基因，暗示其在癌症中的功能重要性。免疫熒光測定表明，METTL16 定位於正常細胞（HEK293T；圖 1a）和癌細胞（Huh7）的細胞核和細胞質中。與主要位於細胞核中的 METTL3 METTL14 不同，大部分內源性 METTL16 分布在細胞質中（圖 1a-c）。異位表達的寬型或突變體（催化死亡突變 F187G 和 PP185/186AA，以及催化活性突變 R200Q）METTL16 也顯示出類似的模式。如前所述，m6A 修飾以共轉錄方式安裝在細胞核中。因此，除了催化 m6A 的形成，METTL16 可能發揮額外的功能，特別是在細胞質中。

圖1. METTL3、METTL14、METTL16的亞細胞分布及m6A催化活性比較分析

METTL16通過與細胞質中的eIF3a/b相互作用促進翻譯起始。 為了闡明METTL16對翻譯促進作用的潛在機制，我們試圖研究其在翻譯起始中的參與和作用，因為起始，而不是延伸或終止，通常是翻譯中最緊密協調的限速步驟，並且METTL16定位於5』 cap區。eIF3作為最大的啟動因子，通過充當mRNA、40S亞基和其他eIF募集的支架而發揮關鍵作用，是刺激翻譯啟動幾乎所有步驟不可或缺的因子。使用eIF3複合物進行的蛋白免疫印跡分析表明，METTL16可能直接且特異性地與eIF3a/b和/或eIF3c結合 (圖3a，b)。隨後的共免疫沉澱 (Co-IPs)證實了METTL16和eIF3a/b之間的直接相互作用，但沒有eIF3c (圖3c，d)。此外，它們的相互作用不依賴於RNA。原位接近連接試驗 (PLA)進一步驗證了METTL16和eIF3a/b之間的物理相互作用 (圖3e)。如預期，大部分原位PLA斑點位於細胞質而非細胞核中 (圖3f，g)。與METTL16 KO相似，eIF3a和eIF3b KO顯著抑制了翻譯效率 (圖3h，I)。在蔗糖密度梯度上，METTL16與eIF3a/b一起在40S、60S和80S核糖體中強烈富集 (圖3j)，表明METTL16和eIF3a/b同時存在，並且參與翻譯起始。此外，大約一半的eIF3a-或eIF3b-結合轉錄物也直接與METTL16結合；超過40%的在METTL16 KO之後具有抑制的翻譯效率的轉錄物也直接被eIF3a和eIF3b結合 (圖3k，l)。METTL16的催化功能增加或喪失突變不影響其與eIF3a/b的相互作用，與我們的觀察結果一致，即METTL16介導的翻譯促進與其甲基轉移酶活性無關。

圖3. METTL16 通過與 eiF3a/b 直接相互作用促進翻譯啟動

METTL16 與 eIF3a/b 和 rRNA 的相互作用促進了 80S TIC 的形成。 引人注目的是，我們發現 METTL16 還直接與核糖體 RNA 相互作用，其程度與其已知靶標的相互作用相當。這種關聯不會發生在其他 METTL 成員中，例如 METTL3，儘管它也增強了翻譯。用截短的 METTL16 突變體交聯免疫沉澱和定量 PCR (CLIP-qPCR) 證明 Mtase 結構域對於 METTL16 和 rRNA 之間的相互作用也是至關重要的 (圖 5a-d)。因此，我們假設 METTL16 與 eIF3a/b 和 18S rRNA（40S 核糖體亞基的核心）之間的相互作用將促進 eIF3a/b 和 18S rRNA 之間的結合，進而促進 eIF3 複合物與 40S 核糖體亞基的相互作用。METTL16 KD 顯着抑制了 eIF3a/b 和 18S rRNA 之間的相互作用，而 METTL16 的恢復可以充分挽救被抑制的關聯（圖 5e-h）。METTL16 與 rRNA 在翻譯起始部分的結合能力遠強於多聚體中的結合能力（圖 5i-k），這突出了 METTL16 與 TIC的關係。此外，我們推測 METTL16 和 28S 5.8S rRNA（60S 核糖體亞基的核心）之間的相互作用可能進一步將 60S 亞基募集到 eIF3 40S 亞基複合體（即 43S PIC）中，從而促進形成80S TIC。我們的核糖體譜顯示 METTL16 KO 顯着減少了 80S 核糖體的形成（圖 5l-n）。體外翻譯實驗直接驗證了 METTL16 增強了翻譯能力（圖 5o）。據報道，METTL16可以增強細胞核中某些靶標（例如MAT2A）的保留內含子的剪接，這反過來可以保護靶標免於衰變並促進它們轉運到細胞質中，從而增強了靶標的翻譯。然而，根據Pendleton和同事生成的數據，只有296個轉錄物在METTL16耗竭細胞中顯示出顯著 (P < 0.05)的內含子保留增加。在METTL16缺失細胞中翻譯效率降低的3638個轉錄物中，只有117個伴有內含子保留增加，表明METTL16介導的翻譯促進與其在內含子剪接中的作用在很大程度上無關。METTL16 eIF3a/b 和 METTL16 18S rRNA（40S 核糖體亞基）相互作用共同刺激 eIF3 複合物和 40S 核糖體亞基之間的相互作用，從而促進 43S PIC 的組裝；額外的 METTL16 28S 5.8S rRNA（60S 亞基）相互作用隨後促進了 80S TIC 的形成，因此促進了翻譯起始（圖 5p）。

圖5. METTL16 通過與 eIF3a/b 和 rRNA 的相互作用促進 TIC 的形成

結論及展望

我們的觀察結果和既往研究表明，METTL3 METTL14主要位於細胞核中，而METTL16優先位於細胞質中。因此，在促進細胞質中的翻譯方面，METTL16可能比METTL3發揮更有效的作用。我們發現METTL16比METTL3更能促進有效翻譯。兩個大規模CRISPR Cas9篩選數據集一致表明，對於各種類型的人類癌細胞的生存，METTL16是比METTL3、METTL14和任何其他METTL基因更重要的基因。在本研究中，我們證明了METTL16在肝癌中起關鍵的促瘤作用，其中METTL16過表達，其表達增加與預後不良相關。METTL16的遺傳耗竭顯著抑制了人類肝癌細胞的生長、遷移和侵襲，並在體內強有力地抑制了腫瘤生長，同時伴隨着全局m6A和翻譯的顯著減少。我們發現翻譯調控中約50%的METTL16靶位也是eIF3a/b的潛在靶位，並且eIF3a/b在HCC中也發揮潛在的致癌作用。因此，靶向METTL16 eIF3a/b軸代表了一種新的癌症治療策略 (例如，HCC治療)。鑑於METTL16的Mtase結構域對其甲基化依賴性和非甲基化活性都至關重要，因此開發針對Mtase結構域的有效抑制劑將是充滿希望的，並在癌症治療中具有巨大的治療潛力。

原文鏈接

https://www.nature.com/articles/s41556-021-00835-2

參考文獻

1.Su Rui,Dong Lei,Li Yangchan et al. METTL16 exerts an mA-independent function to facilitate translation and tumorigenesis.[J] .Nat Cell Biol, 2022, 24: 205-216.

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