儘管在過去十年中有多種新型抗腫瘤療法被開發，兼備無創性和全身抗腫瘤能力的化療仍是臨床中腫瘤治療的主要方法，但目前化療的療效還很不理想。此外，免疫抑制的腫瘤微環境（TME）也會限制化療的療效，導致腫瘤易復發轉移。因此，探索可有效誘導腫瘤免疫原性的新化療靶點，激活免疫系統並逆轉TME的免疫抑制性，有望實現增強的治療效果。
內質網作為細胞中調節蛋白質摺疊和細胞穩態的重要細胞器，已成為新的藥理學靶點。由於大多數腫瘤細胞都處於非致命的持續內質網應激狀態，放大內質網應激可誘導腫瘤細胞凋亡。此外，當腫瘤中內質網應激程度異常增強時，定位在內質網上的免疫原性死亡（ICD）標誌物鈣網蛋白（CRT）會轉移至細胞膜，熟化樹突細胞（DCs）。因此，利用可放大內質網應激的藥物促進CRT在細胞表面的暴露，可能是提升腫瘤免疫原性的理想選擇。
近年來，基於「one-for-all」策略設計的兼備診斷和治療功能的納米藥物被廣泛開發用於影像引導的腫瘤治療。例如第三代含磷樹狀大分子銅絡合物（1G3-Cu），既可將促凋亡蛋白Bax轉運至線粒體，誘導腫瘤細胞凋亡；還可利用Cu進行MR成像。此外，1G3-Cu對線粒體的潛在損傷可能導致另一種ICD標誌物三磷酸腺苷（ATP）的釋放，進一步增強ICD效應。
由於化療藥物往往受困於生物利用度差、單藥療效不足等缺點，具有優異載藥能力的TME響應納米平台被用於整合不同的藥物以提高療效。在眾多納米平台中，響應性聚合物膠束由於可負載疏水藥物、延長血液循環時間以及控制藥物釋放等而具有獨特的優勢。然而，體內的多重生理屏障仍會阻礙膠束在腫瘤中的積累，因此有必要在膠束表面進行額外的仿生修飾以增強其腫瘤特異性。例如，具有免疫逃避性和同源靶向性的癌細胞膜可使納米平台逃脫網狀內皮系統的吞噬並增強其在腫瘤中的積累。考慮到對腫瘤的高效化療可能會引起腫瘤細胞表面免疫檢查點分子表達增加，將化療與免疫檢查點阻斷（ICB）療法結合將有望逆轉免疫抑制的TME並產生長期抗腫瘤免疫記憶效應。
為了解決以上問題，東華大學沈明武/史向陽教授團隊製備了細胞膜仿生、負載了1G3-Cu和內質網應激藥物豐加黴素（Toy）的還原響應型聚合物納米膠束用於化療增強的腫瘤免疫治療（圖1）。研究團隊首先利用含有二硫鍵的兩親性聚合物（PEG-SS-PCL）形成膠束，將1G3-Cu包封在其疏水空腔，並通過氫鍵作用負載Toy，最後在其表面包覆B16黑色素瘤細胞膜（CM），得到還原響應的聚合物納米顆粒（GCT@CM NPs）。製備的納米顆粒一方面可消耗GSH在腫瘤細胞內引起氧化應激，加重腫瘤細胞的內質網應激，同時利用Toy抑制內質網應激恢復穩態，使腫瘤細胞經內質網途徑凋亡；另一方面還可利用1G3-Cu誘導線粒體功能紊亂，使腫瘤細胞經線粒體途徑凋亡。此外，1G3-Cu與Toy可協同作用誘導腫瘤細胞發生ICD，激活抗腫瘤免疫響應。進一步將製備的納米顆粒與PD-L1抗體聯合使用，提高T細胞對腫瘤細胞的識別能力，恢復免疫系統對腫瘤細胞的殺傷作用，可產生長期、持續的免疫效應，有效抑制腫瘤的生長、轉移或復發。
研究團隊首先通過TEM和SEM等證明了GCT@CM NPs的成功合成（圖2A-C），並且在NPs的表面保留了癌細胞膜表面的CD47蛋白用於免疫逃避（圖2D）。製備的GCT@CM NPs由於CM的包覆而具有增強的抗蛋白吸附能力（圖2E），並在水、PBS以及培養基中具有良好的膠體穩定性（圖2H）。在不同濃度GSH條件下，GCT@CM NPs會響應性解離並釋放Toy（圖2I-J）。
圖2.（A）GCT NPs的TEM圖；GCT@CM NPs的（B）SEM圖及（C）TEM圖；（D）CD47蛋白的保留情況；（E）各材料的抗蛋白吸附能力；各材料的（F）水合粒徑及（G）電勢；（H）GCT@CM NPs在水、PBS以及培養基中的粒徑變化曲線；（I）不同條件下GCT@CM NPs粒徑的變化；（J）不同條件下Toy的累積釋放曲線。
研究團隊通過細胞毒性實驗及細胞吞噬實驗證明，GCT@CM NPs對B16細胞具有增強的靶向性，可通過1G3-Cu與Toy的協同作用顯著抑制B16細胞的活力（圖3A-C）。並且，GCT@CM NPs可在細胞內消耗GSH、產生ROS，引起腫瘤細胞內氧化應激（圖3D-G）。進一步實驗結果表明，GCT@CM NPs通過氧化應激加重了內質網應激，並利用負載的Toy抑制了細胞內XBP1s的表達，從而通過加重內質網應激及抑制內質網應激恢復穩態使腫瘤細胞經內質網途徑凋亡（圖3I-M）。
圖3.不同材料處理（A）B16細胞或（B）L929細胞後的細胞活力圖；（C）不同材料處理B16細胞和RAW 264.7細胞後細胞內銅元素含量分析圖；（D）不同材料處理後B16細胞內GSH水平分析圖及（E-G）ROS水平分析圖；（H）Toy在細胞內的作用機制示意圖；（I-L）不同材料處理後B16細胞內相關基因的表達水平及（M）相關蛋白的Western blot試驗結果圖。
隨後，團隊研究了GCT@CM NPs對細胞線粒體功能的影響。實驗結果表明，製備的NPs可利用負載的1G3-Cu使線粒體膜電位下降，誘導線粒體功能障礙（圖4A-B）。進一步研究發現，整合了Toy與1G3-Cu的GCT@CM NPs誘導了更多的細胞發生凋亡（25.68%），並且可使促凋亡蛋白Bax、p53及PTEN上調，抗凋亡蛋白Bcl-2下調（圖4C-E）。此外，GCT@CM NPs可通過加重內質網應激使CRT外翻，通過線粒體損傷刺激ATP釋放，從而在體外誘導腫瘤細胞發生ICD，並刺激DCs熟化（圖4F-I）。
圖4.（A）1G3-Cu在細胞內的作用機制示意圖；（B）不同材料處理後B16細胞內線粒體膜電位變化分析圖；（C-D）不同材料處理後B16細胞凋亡情況流式分析及（E）凋亡相關蛋白的Western blot試驗結果圖；（F）B16細胞與各組材料共孵育引起ICD，並刺激DCs熟化的示意圖；不同材料處理後細胞內（G）HMGB-1的釋放及（H）CRT表達情況分析圖；（I）各組材料刺激DCs熟化的流式分析圖。
隨後，研究團隊在小鼠體內構建了B16皮下瘤模型，通過MR成像驗證了GCT@CM NPs在體內具有腫瘤主動靶向性及延長的血液循環時間。在體內抗腫瘤實驗中，GCT@CM NPs具有最佳的腫瘤抑制效果，可在體內誘導腫瘤細胞發生ICD，並招募細胞毒性T細胞進入TME。進一步將GCT@CM NPs與PD-L1抗體（Anti-PD-L1）聯合使用發現，Anti-PD-L1可提高T細胞對腫瘤細胞的識別能力，使GCT@CM NPs+Anti-PD-L1組小鼠的腫瘤體積最小（圖5A-E）。經流式分析發現，聯合治療使小鼠脾臟及腫瘤浸潤的CD4+、CD8+T細胞比例顯著上升，腫瘤部位Tregs的比例下降，免疫抑制的TME被逆轉，表明化療引起的ICD與ICB療法聯合可引起最有效的免疫應答（圖5F-K）。
圖5.（A）小鼠體內聯合治療過程示意圖；不同材料治療14天內（B）相對腫瘤體積變化圖、（C）小鼠相對體重變化圖及14天後的（D）腫瘤照片和（E）腫瘤重量；各實驗組經治療14天後，（F）脾臟及（G）腫瘤組織中CD8+與CD4+T細胞分型的流式細胞分析圖及（H-I）腫瘤組織中Tregs的表達水平分析；（J）CD8+T細胞與Tregs的比值；（K）治療後各組小鼠血清中IFN-γ表達水平分析。
為了驗證GCT@CM NPs+Anti-PD-L1的聯合療法在體內產生長期免疫記憶的能力，研究團隊在聯合治療的基礎上進行了腫瘤再挑戰及抗轉移實驗（圖6A）。研究發現聯合治療使小鼠脾臟中的記憶T細胞含量顯著增加（圖6B-C），並可在再次輸入B16細胞後顯著抑制再挑戰腫瘤的生長以及腫瘤的肺轉移（圖6D-G）。
圖6.（A）小鼠體內腫瘤再挑戰及抗轉移實驗示意圖；（B-C）經聯合治療後各組小鼠脾臟中記憶T細胞比例分析；（D）各組小鼠再挑戰腫瘤中T細胞分型分析及（E）CD8+與CD4+T細胞的比值；（H）各組小鼠經治療後抗轉移實驗結果。
簡而言之，該研究設計的GCT@CM NPs納米平台具有多個優勢：1）構建的NPs聯合CM顯著提高了1G3-Cu和Toy的生物利用度並降低了它們的副作用，使1G3-Cu和Toy在TME中響應性釋放，從而通過線粒體和內質網應激兩個途徑誘導腫瘤細胞凋亡；2）Toy介導的內質網應激放大可以與1G3-Cu誘導的線粒體功能障礙協同作用，增強ICD效應，熟化DCs並招募免疫細胞進入TME；3）GCT@CM NPs與Anti-PD-L1聯合使用，可產生長期免疫應答，抑制腫瘤的復發和轉移。本研究製備的GCT@CM NPs為整合不同的治療靶點以實現化療增強的免疫治療提供了新的思路。
以上研究成果以「Biomimetic Polymeric Nanoparticle-Mediated Chemotherapy Potentiates Enhanced Tumor ImmunotherapyviaAmplification of Endoplasmic Reticulum Stress and Mitochondrial Dysfunction」為題，在線發表於國際著名期刊Advanced Materials(DOI: 10.1002/adma.202206861)。東華大學生物與醫學工程學院史向陽教授與沈明武教授為共同通訊作者，博士生郭雲琦和范鈺為共同第一作者。該工作得到了國家自然科學基金國際(地區)合作與交流項目、上海市科委政府間國際合作項目及中央高校研究生創新基金等項目的資助。文章鏈接：
https://doi.org/10.1002/adma.202206861
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