ACS美國化學會 - ACS Chem. Biol. │ 基於Split-適配體設計新型誘導式CRISPR-dCas9轉錄激活系統－鑽石舞台

英文原題：A Small-Molecule-Mediated Split-Aptamer Assembly for Inducible CRISPR-dCas9 Transcription Activation

通訊作者：Fenglin Wang 湖南大學

供稿人：劉宏宇北京大學

大家好，今天為大家介紹一篇ACS Chemical Biology 的文章「A Small-Molecule-Mediated Split-Aptamer Assembly for Inducible CRISPR-dCas9 Transcription Activation」。文章的通訊作者是來自湖南大學的Fenglin Wang課題組。在這篇文章中，作者開發了一種基於Split-適配體的誘導型CRISPR-dCas9轉錄激活系統。

dCas9（nuclease-deficient Cas9）是一種失活突變的Cas9蛋白，其失去了切割DNA的能力，但保留了與gRNA（guide RNA）和目標DNA的識別能力。CRISPR-dCas9系統保留了CRISPR-Cas9系統精準的DNA定位能力而不切開DNA，因此，CRISPR-dCas9系統可以在細胞內提供精確的DNA靶標定位。進一步的，將CRISPR-dCas9設計為條件激活的誘導型CRISPR-dCas9，將其與轉錄因子結合，可以進一步幫助科學家時空定位調控DNA轉錄。

目前，誘導型CRISPR-dCas9的設計思路主要有兩種：第一種為將dCas9做成Split-dCas9蛋白，當被分割的兩部分dCas9在其他條件的控制下結合在一起時，dCas9恢復活性，招募轉錄因子啟動轉錄調控；第二種是調控gRNA與dCas9蛋白的結合，從而控制轉錄的啟始。目前已經有基於小分子、核酸以及蛋白等多種模式來調控gRNA的結合能力，先前該課題組針對第二種策略，開發了基於雜交切割以及miRNA介導的gRNA釋放等方式來調控gRNA靶向性的方法。在本文中，作者利用基於小分子SAM（S-腺苷甲硫氨酸，S-adenosyl methionine）的Split-適配體（aptamer），開發了一種新型的誘導式CRISPR-dCas9轉錄激活體系，該體系可以用於在細胞內高靈敏度地定量測定SAM的濃度。

首先，作者利用了SAM的Split-適配體來進行設計。在DNA靶向部分的設計上，他們將適配體的一個片段與gRNA融合，用於小分子的DNA靶向；其次，他們將另一片段的適配體與MS2片段融合， MCP蛋白（MS2 coat protein）可以與MS2片段特異性的結合來幫助轉錄因子定位到目標區域。在匯報系統的設計上，他們首先將轉錄激活因子（VPR）與MCP融合組成MCP-VPR，這樣在SAM結合的介導下，MS2首先會被CRISPR-dCas9系統招募到靶標DNA附近。通過融合蛋白上的MCP對MS2的結合，轉錄結合因子VPR可以在定位在匯報基因附近，啟動匯報蛋白iRFP670的表達。基於以上思路，他們分別設計了FragC-iRFP和dCas9-MCP兩個質粒來遞送該系統（如下圖所示）。

圖1. A基於SAM適配體的誘導型CRISPR-dCas9轉錄激活系統的設計 ; B基於SAM的Split-適配體 ;C誘導型CRISPR-dCas9轉錄激活系統的質粒構建

作者分別用熒光成像的方式來表徵該體系是否可以成功的在SAM的介導下，轉錄iRFP的表達。首先從熒光成像中，通過mCherry的表達可以表徵質粒FragC-iRFP的成功轉入；其次他們通過對照實驗證明了該體系確實可以依賴Split-SAM適配體轉錄iRFP的表達。從成像中我們可以看到，在轉入單一適配體片段時，細胞中不能看到iRFP的表達（圖2A-a,b），而表達完整體系時，在細胞內源SAM的介導下，iRFP成功表達（圖2A-c）。Cycloleucine是一種內源SAM合成抑制劑，其可以抑制內源SAM的水平。相比對照組，在加入Cycloleucine時，內源性的SAM信號消失，而外加SAM組可以提高iRFP的表達水平（圖2A-d,e）。所以以上結果證明，這種基於Split-適配體的CRISPR-dCas9體系可以對SAM靈敏響應，從而通過iRFP的熒光強度來表徵細胞內SAM的水平。

圖2. 誘導型CRISPR-dCas9轉錄激活系統可以用於SAM的特異性成像

既然該體系可以對SAM進行穩定響應，隨後他們想利用該體系是否可以進一步定量的檢測細胞內SAM的濃度。首先作者通過控制外加不同濃度的Cycloleucine和SAM，來產生細胞內不同的SAM的濃度梯度。他們選擇用iRFP的熒光強度與mCherry的熒光強度的比值來表徵SAM的濃度，這樣可以扣除由於質粒轉染效率帶來的差異性。通過比較UPLC-MS/MS的測量結果比較，作者發現iRFP/mCherry的熒光比值可以在一定範圍內與UPLC-MS/MS測得的SAM濃度成線性關係，這表明，這種方法可以在一定範圍內定量的檢測細胞內SAM的濃度水平。

圖3. 誘導型CRISPR-dCas9轉錄激活系統可以定量監測細胞內SAM的細胞濃度

接下來，作者利用該體系，比較了不同細胞系中SAM的濃度水平。作者利用UPLC-MS/MS檢測了HepG2，HeLa，MCF-7以及HEK-293T的SAM濃度水平，然後他們利用該系統同樣檢測了SAM濃度水平。結果顯示，在不同細胞中，iRFP/mCherry的熒光比值均可以很好的反應SAM的表達水平。進一步的利用可以抑制SAM水平的抑制劑處理不同細胞系時，這種方法也可以很好的監測SAM的濃度的變化。

圖4. A 在HepG2,HeLa, MCF-7和HEK-293T細胞系中監測SAM的濃度;B在利用抑制SAM水平的抑制劑處理不同細胞系細胞後，監測SAM的濃度變化

總之，本文作者開發了一種基於Split-適配體的CRISPR-dCas9轉錄激活體系，該體系可以在小分子SAM的介導下，啟動匯報蛋白iRFP的轉錄。該體系可以對細胞內SAM靈敏響應，並且可以用於定量的檢測細胞內SAM的濃度水平。這種方式在提供了一種新型的誘導式CRISPR-dCas9轉錄激活體系設計策略的同時，提供了一種小分子濃度依賴的條件控制轉錄水平的新方法。

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