近日，北京大學生命科學學院、北大-清華生命科學聯合中心胡家志課題組在Nature Communications期刊發表了題為：Comprehensive assessment of miniature CRISPR-Cas12f nucleases for gene disruption的研究論文。該研究應用了PEM-seq技術對領域內多種CRISPR-Cas系統的編輯活性、脫靶效應以及對基因組穩定性的影響進行了橫向比較，重點描繪了CRISPR-Cas12家族編輯工具的特徵。編輯活性：作者首先利用GFP熒光報告系統以及PEM-seq技術對領域內四種新型的Cas12f核酸酶（Un1Cas12f1_ge4.1, CasMINI, CasMINI_ge4.1,AsCas12f1），兩種Cas12e核酸酶（PlmCas12e及其優化版本PlmCas12e-R1-v2）以及SpCas9、AsCas12a、LbCas12a的編輯活性進行了詳細比較。作者發現了新型的Un1Cas12f1、兩種CasMINI及PlmCas12e-R1-v2編輯工具在HEK293T細胞中展現了相對有效的編輯活性，儘管其效率普遍低於Cas9或Cas12a；而AsCas12f1及PlmCas12e在大多數位點的編輯效果不佳（圖一A-B）。這與之前研究人員猜測AsCas12f1嗜熱酶的特性使得其在人類細胞中很難實現最佳的切割活性相吻合3。該研究進而分析了在有效編輯活性下這些不同CRISPR-Cas系統產生的小規模插刪（small insertions and deletions，indels）產物的序列特徵。作者發現，與Cas9相比，Cas12核酸酶編輯基因組後更傾向於產生缺失產物，並且其鹼基缺失的長度與Cas12核酸酶不對稱切割兩條DNA鏈所產生黏性末端的突出（overhang）長度相關（圖一C），暗示了Cas12編輯更適用於某些需要對特定DNA片段進行刪除從而實現治療效果的臨床疾病。相應地，Cas12大大降低了鹼基插入的比例，包括在SpCas9編輯產物中頻繁出現的1-bp插入。這些結果暗示了不同斷裂末端對基因編輯產物的影響。圖一. 通過EGFP沉默實驗和PEM-seq技術評估微型Cas12核酸酶的編輯能力。A. 不同CRISPR-Cas系統在HEK293T-d2EGFP細胞系的編輯效率檢測流程圖。B. 在指定靶位點不同Cas酶的GFP基因破壞效率。C. 不同CRISPR-Cas系統編輯產生的鹼基缺失長度的模式圖。脫靶活性：進一步，該研究發現Cas12f核酸酶具有相對更高的編輯特異性，儘管這種高特異性可能是由於其與Cas9和Cas12a核酸酶相比而言，整體較低的編輯活性。在研究者檢測的大多數位點上，都幾乎檢測不到Cas12f的脫靶位點，而與之共享靶向序列的SpCas9卻能夠檢測到大量的脫靶位點，說明了Cas12f具有較低的脫靶活性（圖二A）。這可能是由於Cas12f對於PAM的識別特異性較高，或者其相對較低的編輯活性所導致。染色體結構變異：該研究隨後利用PEM-seq分析方法詳細比較了各種CRISPR-Cas系統所產生的基因編輯副產物。作者發現了染色體易位、染色體大片端缺失這些有害的基因編輯副產物普遍存在於各個CRISPR基因編輯系統中，但Cas12f核酸酶可以相對有效地抑制這些副產物的產生，這可能與Cas12f編輯酶切割基因組後產生的黏性末端影響了DNA修復途徑相關。具體而言，在該研究所檢測位點上，SpCas9平均產生了占編輯事件3.6%的染色體易位，1.9%的染色體大片段缺失副產物；而四種Cas12f產生的染色體易位比例處於1.2%-1.6%之間，產生的染色體大片段缺失比例處於0.5%-1.2%之間（圖二B-C）。雖然這些染色體結構異常的發生頻率相對較低，但常常與癌症的發生相偶聯，是基因編輯過程中值得注意的副產物。外源DNA片段插入：值得警惕的是，作者在靶向位點也發現了大片段的DNA插入事件，通過與遞送質粒序列進行比對，發現了這些片段來源於遞送載體，外源DNA片段的插入會影響插入位點附近其他基因的表達情況甚至引發細胞癌變，為基因編輯帶來了不確定性。SpCas9平均產生了占編輯事件5.2%的外源DNA片段插入副產物，而Cas12f切割所導致的的外源DNA片段插入事件的比例可降至1.1-2.2%之間（圖二D）。圖二. PEM-seq全面評估各種CRISPR-Cas編輯系統的基因編輯副產物。A. 不同編輯工具在FGF18位點所產生的脫靶位點的數目與分布。B-D. 不同Cas酶在基因編輯中所產生的染色體易位事件（B），染色體大片段缺失（C），外源DNA片段插入（D）的比例。總體而言，該工作利用PEM-seq技術系統地比較了各個CRISPR-Cas編輯系統編輯過程中的DNA修復產物，揭示了不同斷裂末端影響各類編輯產物的潛在機制，也為新型Cas12f基因編輯工具的臨床應用做出了前瞻性的指導。該工作也證實了PEM-seq技術方法用於描繪基因編輯工具特徵的廣譜適用性、全面性與高靈敏性。但目前Cas12f仍存在着總體編輯活性較低的問題，保持其安全性的同時並進一步提高其編輯效率，將極大地推動微型基因編輯工具的廣泛應用。胡家志團隊之前將核酸外切酶與Cas9相偶聯生成Cas9TX的思路，為這些新型編輯工具的優化提供了方向。https://www.nature.com/articles/s41467-022-33346-1
鑽石舞台 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()
留言列表
留言列表