自然界中，許多生物通過適應複雜的環境，進化出了合適的結構和功能，為再生領域生物材料支架的研發提供了思路。例如，紅杉是一種常見的針葉樹，它具有複雜的微結構，具有放射狀排列的微通道和波狀多孔網絡，這些微通道和網絡對物質循環、能量傳遞和細胞生長做出了巨大貢獻。這些功能和特性是細胞代謝和組織再生所必需的。研究者們從這些特殊的結構和獨特的功能特性中獲得靈感，製造出各種仿生紅木樣材料，這些材料在能源儲存和轉換、智能材料、組織工程等許多領域都表現出卓越的性能。紅杉類生物材料的放射狀層次結構和功能特性可能在細胞反應的調節中發揮積極作用，如引導和促進細胞遷移和細胞分化，從而實現快速的骨再生。但是該結構需要較強的力學性能。仿生紅木的放射狀支架和硅（Si）改性磷酸鈣（CaP）納米塗層（SCPN）的結合是一個很好的選擇，這改善了材料的理化性能，最終促進成骨和血管生成。因此，武漢大學中南醫院骨腫瘤科的蔡林教授和武漢大學基礎醫學院陳雲教授團隊構建仿生紅木結構的含硅混合納米塗層支架促進血管和骨的生成。
首先，研究者對支架進行表徵。研究者將表氯醇交聯的羥乙基纖維素和大豆蛋白隨機多孔支架（HS-RP）、單純紅木結構樣支架（HS-RW）還有SCPN塗層的紅木結構樣支架（SCPN-HS-RW）進行對比，發現HS-RW和SCPN-HS-RW有明顯的紅木仿生放射狀結構，支架表面有明顯的SCPN。SCPN塗層在支架上均勻分布，且該塗層明顯增加了支架表面的親水性及表面積，從而有望為細胞粘附和組織粘附提供更多的結合位點，為細胞提供了更好的生理微環境。X射線光電子能譜學(XPS)也證實了成功的表面功能化，在納米複合材料中顯示了具有不同強度的Ca、P和Si峰，而在HS-RP和HS-RW中沒有這些峰。X射線衍射分析（XRD）和傅里葉變換紅外光譜(FTIR)也進一步驗證了各組的結構（圖1，2）。
隨後研究者對支架的力學及相關物理特性進行分析。結果顯示，所有支架在水中都具有一定的剛度和抗變形能力，但SCPN-HS-RW的抗壓強度、壓縮模量以及抗溶脹能力都是最強的。SCPN-HS-RW在PBS中浸泡後可保持其幾何形狀，說明SCPN的加入可以有效抑制支架腫脹。HS-RW組和SCPN-HS-RW組吸附蛋白質能力均比HS-RP組強。Ca和Si的釋放曲線表明SCPN-HS-RW組能夠維持Ca和Si的持續釋放，說明紅木樣支架的層次結構對維持生物活性離子的持續釋放起關鍵作用。SCPN-HS-RW組的降解速率最慢，故能長期維持其表面形貌（圖3）。
緊接着研究者對支架體外細胞生物相容性進行了研究，檢測了骨髓間充質幹細胞（BMSC）和人臍帶靜脈內皮細胞（HUVEC）在不同支架浸提液中培養1、2和3天後代謝活性。各時間點各組浸提液對BMSC及HUVEC均無明顯毒性作用。流式細胞術定量分析細胞凋亡結果也顯示兩種細胞均有較高的存活率。研究者將兩種細胞直接種植於支架上，共聚焦顯微鏡觀測結果顯示：在HS-RP組中，大多數細胞保持圓形的細胞簇和稀疏的分布，表明由於缺乏細胞附着的生物活性表面，細胞親和性較低。但在SCNP-HS-RW和HS-RW結構上，特別是在SCNP-HS-RW結構上，觀察到代表活細胞的強烈綠熒光，表明SCNP-HS-RW組對細胞增殖有促進作用。HS-RW和SCNP-HS-RW組的骨架染色結果表明細胞分布均勻，細胞呈典型的細長紡錘形形態，細胞沿支架表面結構取向排列（圖4）。
然後研究者進一步分析了2D、3D環境中支架的血管生成和成骨的影響。孵育24 h後，SCPN-HS-RW組遷移細胞數量顯著多於其他各組。SCPN-HS-RW浸提液組形成了更多的毛細血管狀網絡，形態特徵良好，而其他各組僅出現少量脆弱管狀結構。第7天測定鹼性磷酸酶(ALP)活性，結果顯示，SCPN-HS-RW組的ALP的表達量最高；第21天進行茜素紅（ARS）染色，SCPN-HS-RW處理組出現最密集的紅色結節，進一步證明納入SCPN可顯著促進骨髓間質幹細胞的成骨分化。為了進一步評估支架對體外血管生成活性的影響，研究者在3D細胞培養中對CD31和𝛼-SMA進行免疫熒光染色，SCPN-HS-RW組中表達明顯高於其他兩組。通過qRT-PCR分析兩種關鍵的血管生成相關標誌物HIF-1𝛼和VEGF的表達情況。正如所料，培養7天後，SCPN-HS-RW組HIF-1𝛼和VEGF的表達明顯高於其他支架組，提示其具有良好的體外血管生成活性。3D環境下的ALP和ARS的染色結果與2D培養一致。為了進一步闡明SCPN-HS-RW對成骨相關蛋白和基因表達的影響，研究者分析了Runx2、Col-1、OPN和OCN標記蛋白和基因的表達，結果表明SCPN-HS-RW組具有最強的成骨能力（圖5，6）。
最後研究者通過大鼠顱骨缺損模型評價各支架在體內促骨修復情況。研究者採用X線、micro-CT、組織學染色和免疫組化染色對整體骨修復水平進行定性和定量評價。植入後5周，HS-RW組和SCPN-HS-RW組均比其他組充滿更多的新礦化基質。植入後第10周，SCPN-HS-RW組在整個缺損區域觀察到更多的再生骨組織，micro-CT結果顯示新生骨幾乎閉合骨缺損區域。基於micro-CT圖像的定量分析，包括骨體積占總體積的百分比(BV/TV)、骨密度(BMD)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和小梁分離(Tb.Sp)進一步證實了上述發現，SCPN-HS-RW組的成骨能力最強。為了進一步評估骨缺損癒合過程中的新骨形成和礦化，在植入10周顱骨缺損切片進行H&E染色、Masson三色染色和Goldner三色染色。結果表明SCPN-HS-RW組再生的礦化骨更多，具有層狀結構，且厚度與原始骨相似。SCPN-HS-RW組誘導了更多的骨樣組織以及礦化的膠原纖維和明顯的新生血管，表明SCPN-HSRW可以引導更有效的帶血管化的骨再生。免疫組織化學和免疫熒光分析進一步評估10周時不同支架的成骨和新生血管形成情況，骨及成血管相關蛋白的表達量明顯增高。以上結果表明SCPN-HS-RW組具有最強的成骨及成血管作用（圖7）。
本研究由武漢大學中南醫院骨腫瘤科的蔡林教授和武漢大學基礎醫學院陳雲教授團隊完成，並於2021年12月發表於Adv. Healthcare Mater。
論文信息：Minhao Wu, Feixiang Chen, Ping Wu, Zhiqiang Yang, Sheng Zhang, Lingfei Xiao, Zhouming Deng, Chong Zhang, Yun Chen*, and Lin Cai*. Bioinspired Redwood-Like Scaffolds Coordinated by In Situ-Generated Silica-Containing Hybrid Nanocoatings Promote Angiogenesis and Osteogenesis both In Vitro and In Vivo. AdvHealthcare Mater 2021, 10(23): 2101591.
供稿：韓峰
審校：袁章琴
編輯：於麗麗
留言列表