鑽石舞台

哺乳動物的中樞神經系統缺乏內在的再生能力，因而不可取代失去的神經元和誘導功能恢復。再生醫學的目標是採用以細胞為基礎的策略去取代受損的神經元，進而恢復失去的功能，並糾正神經缺陷。針對這一目標，科學家通過強迫表達神經源性轉錄因子（Transcription factors, TFs），實現腦駐留膠質細胞向臨床相關誘導神經元（induced neurons, iNs）的命運轉換，以替代丟失的神經元和恢復丟失的大腦功能【1-2】。儘管膠質細胞到神經元的重編程有望成為一種神經元替代策略，但依舊面臨的一個關鍵問題是：iNs是否具有在病理環境下促進功能恢復的能力？臨床上的重編程要求iNs功能性地、穩定地整合入神經環路中，不僅能從內源神經元接收突觸輸入，同時還可以選擇性地將軸突發送到目標神經元，最終恢復失去的突觸傳輸能力，發揮治療效果。

伴海馬硬化性顳葉內側癲癇（Mesial temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis, MTLE-HS）是一種特徵明確的癲癇綜合徵，是局灶性癲癇最常見的形式，也是人類癲癇中最難治療的形式之一，常發展為藥物難治性癲癇，需要手術治療。MTLE-HS患者最常描述的組織病理學特徵包括CA1和CA4海馬亞區嚴重的神經元缺失以及反應性膠質增生。其中，最重要的一個特徵是不同亞型的海馬GABA能中間神經元的退化。研究表明GABA能神經元丟失可以促進癲癇狀態【3】。目前，儘管對致癇區進行侵入性切除手術可以提供潛在的癲癇控制，但多達40%的手術患者出現早期或晚期手術失敗。因此，急需開發新的治療策略控制MTLE-HS患者的癲癇發作。

2021年9月29日，來自法國里昂大學的Christophe Heinrich團隊在Cell Stem Cell雜誌在線發表了題為Reprogramming reactive glia into interneurons reduces chronic seizure activity in a mouse model of mesial temporal lobe epilepsy的研究論文。研究人員在MTLE小鼠模型中，通過共表達轉錄因子Ascl1和Dlx2將海馬區的反應性膠質細胞重編程為GABA能神經元（iNs），有效地減少了慢性癲癇發作。這項研究揭示了膠質細胞到神經元（glia-to-neuron）的重編程可以作為一種潛在的疾病治療策略，用以治療頑固性癲癇。

作者之前的研究表明，逆轉錄病毒驅動的轉錄因子Ascl1和Dlx2的表達可以在體外指導出生後皮質星形膠質細胞的重編程，產生功能性的、帶有突觸的GABA能iNs【4】。那麼glia-to-neuron的轉換是否可以在癲癇海馬腦區內實現呢？為了回答這一問題，作者構建了一種成熟的慢性MTLE-HS小鼠模型（簡稱MTLE-HS小鼠）：該模型通過在成年小鼠海馬內注射紅藻酸鹽（Kainite, KA）獲得，重現了人類MTLE-HS的大多數病理生理性特徵。研究人員首先將編碼Ascl1和Dlx2的逆轉錄病毒在體外轉導入皮質星形膠質細胞中，24 h後，將細胞移植到MTLE-HS小鼠海馬的齒狀回，檢測其是否能在體內轉化為GABA能iNs。結果顯示，大約70%的Ascl1/Dlx2轉導的細胞表達典型的神經元標記物NEUN，約80%的神經元具有MAP2+樹突結構，說明Ascl1和Dlx2聯合表達可以在體內指導膠質細胞高效生成iNs。進一步分析發現，在Ascl1/Dlx2共表達時，80%的NEUN+ iNs分化為GABA能神經元。此外，一部分NEUN+ iNs還表達了calretinin（CALB2; 30%）、somatostatin（SST; 30%），或vasoactive intestinal peptide （VIP; 40%），說明這些神經元在一定程度上有明確的中間神經元的特徵。

上述結果表明在癲癇病理環境中可以實現膠質細胞到神經元的轉換，作者接下來的目標是在MTLE-HS小鼠中開發一種將內源性海馬膠質細胞轉化為GABA能iNs的策略。作者採用Moloney鼠白血病病毒（Moloney mouse leu kemia virus）為基礎的逆轉錄病毒特異性地靶向MTLE-HS小鼠海馬中的反應性增生膠質細胞。為了將反應性海馬膠質細胞重新編程為中間神經元，如圖1所示，先在MTLE-HS小鼠中連續注射5天KA，隨後，注射編碼Ascl1和Dlx2的逆轉錄病毒。結果顯示，Ascl1/Dlx2聯合表達誘導海馬神經膠質細胞高效重編程為表達未成熟神經元標記物DCX的iNs（67%的DSRED+細胞），並在7 dpi時呈現未成熟神經元形態。隨着存活時間的延長，這些iNs表現出複雜的神經元形態，並延伸多個分支，在MTLE-HS小鼠海馬齒狀回中形成緻密的纖維網絡。與之前的結果一致，這些新生的iNs主要為GABA能神經元，並具有明顯的中間神經元特徵。因此，這些結果證明成年MTLE-HS小鼠海馬中的反應性膠質細胞可以有效地轉化為GABA能iNs。

圖1. 誘導海馬反應性膠質細胞產生iNs的實驗流程

隨後，作者利用狂犬病病毒（RABV）介導的逆行單突觸追蹤技術研究了iNs在成年MTLE-HS小鼠大腦內源性網絡中的突觸整合情況。數據表明，iNs同時連接了海馬顆粒細胞（Granule cells, GCs）的突觸前和突觸後，值得注意的是，iNs並沒有將其軸突投射到MTLE-HS小鼠的海馬外側，這一特徵與海馬GABA能中間神經元一致。iNs是否具有生理功能，是否可以與GCs形成完整突觸？作者採用了一種基於ChR2在iNs中選擇性表達的光遺傳策略：在海馬反應性膠質細胞或皮質星形膠質細胞中，同時表達Ascl1/Dlx2（DsRed）和ChR2（GFP），然後移植到MTLE-HS小鼠的海馬中。通過全細胞膜片鉗記錄結果顯示，iNs能響應去極化step-current注入而產生重複動作電位，說明海馬膠質細胞原位或移植星形膠質細胞衍生的iNs都具有一定的生理功能。進一步，作者在電流鉗記錄GCs的膜電位的同時，用短激光脈衝刺激CHR2+ iNs，證明了iNs與內源性GCs形成了突觸連接，iNs在GCs上建立了功能性的GABA能突觸。

那麼來自海馬反應性膠質細胞的iNs是否能減少疾病慢性期自發性海馬癲癇的復發？如圖2A所示，作者先給小鼠海馬注射編碼Ascl1/Dlx2的逆轉錄病毒或對照逆轉錄病毒，6-8周後，注射KA，最後記錄小鼠的腦電圖（EEG）活動。根據MTLE-HS模型的經典癲癇發作分析，量化了海馬腦電圖癲癇發作的次數和持續時間。實驗結果顯示，對照組MTLE-HS小鼠癲癇發作平均次數約為30次/小時，累積發作持續時間約為17分鐘/小時；注射Ascl1 Dlx2的逆轉錄病毒MTLE-HS小鼠癲癇發作次數與時間與對照組相比較均顯著下降（圖2B-2E），說明Ascl1/Dlx2誘導的內源性海馬膠質細胞向GABA能iNs的轉化可以顯著降低MTLE-HS小鼠慢性癲癇發作活性。

綜上所述，研究人員通過表達Ascl1和Dlx2，成功地將內源性和移植的神經膠質細胞重編程為MTLE-HS小鼠模型中的GABA能iNs。這些iNs可以在功能上整合到癲癇網絡中，並在海馬GCs細胞上建立GABA能突觸。GABA能iNs在疾病的慢性期顯著降低MTLE-HS小鼠自發性癲癇復發活動。該研究揭示了在體內的膠質細胞到神經元的重編程是一種潛在的基於細胞的治療策略，而對於MTLE-HS患者來說，採用有效的治療策略控制癲癇發作是非常必要的，因此該策略為抗藥性癲癇疾病患者帶來了新的曙光。作者認為該研究依舊存在一些未解決的問題：（1）分化的海馬反應性膠質細胞（星形膠質細胞、NG2膠質細胞或小膠質細胞）中哪些亞型轉化為了iNs，不同的細胞來源是否影響重編程結果；（2）反應性膠質細胞的重編程是否會導致微環境的重塑，從而對組織穩態產生有利或不利的結果；（3）膠質細胞群是否主要通過膠質細胞增殖的穩態控制來維持；（4）在未來的臨床應用中，需要設計無創的基因重編程遞送方式。

[1] Barker, R.A., et al. (2018). New approaches for brain rapair-from rescue to reprogramming.Nature557, 329-334.

[2] Vignoles, R., et al. (2019). Direct lineage reprogramming for brain repair: breakthroughs and challenges.Trends Mol. Med.25, 897–914.

[3] Cobos, I., et al. (2005). Mice lacking Dlx1 show subtype-specific loss of interneurons, reduced inhibition and epilepsy.Nat. Neurosci.8, 1059-1068.

[4] Heinrich, C., et al. (2011a). Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.Nat. Protoc.6, 214-228.