導讀妊娠糖尿病（GDM）是最常見的妊娠併發症之一，該併發症可導致母親和嬰兒的發病率和死亡率升高，代謝組學為GDM的病理提供了新的見解，為了給GDM的診斷和機制提供更多線索，我們需要對GDM的代謝物進行系統分析。本研究旨在正常孕婦與GDM患者在妊娠中期和晚期的代謝差異，並證實這些新發現的臨床相關性。我們分別對200名健康孕婦和200名妊娠中期GDM婦女、199名正常對照和199名妊娠晚期GDM患者的血清樣本進行代謝物定量檢測，並通過功能和通路分析來探索兩組代謝物的生物學作用，然後結合機器學習方法識別妊娠期特異性GDM代謝物生物標誌物，並構建logistic回歸模型評估代謝物的預測效率。最後，利用加權基因共表達網絡分析方法進一步捕捉代謝模塊與生物標誌物和臨床指標之間的關聯。本研究在妊娠中期組發現了57個差異表達代謝物（DEMs），其中以3-甲基-2-氧戊酸表達最顯著，同樣，在妊娠晚期組發現72個DEMs，最顯著的代謝物是酮亮氨酸和α -酮異戊酸，這些DEMs主要參與氨基酸、脂肪酸和膽汁酸的代謝途徑。我們對選定的代謝物生物標誌物進行logistic回歸模型分析，在妊娠中期和妊娠晚期組的曲線值下面積分別為0.807和0.81，此外，我們在DEMs /標誌物和GDM相關指標之間發現了顯著的相關性。本研究發現了健康孕婦與GDM患者之間存在代謝差異，同時還研究了生物標誌物與臨床指標之間的關係，這可能為GDM的病理發展提供新的認識。
原名：Discovery of metabolic biomarkers for gestational diabetes mellitus in a Chinese population期刊：Nutrition & Metabolism
所有研究對象的臨床特徵見表1。與正常孕婦相比，在妊娠中期和晚期，發生GDM的孕婦在OGTT後空腹血糖、餐後1小時和2小時血糖水平較高，且妊娠期間BMI變化較小。妊娠中期，病例組與對照組的HbA1c、TG、TC、LDL水平均有統計學差異，這與既往研究的結論一致。妊娠晚期GDM患者與健康孕婦的TC、分娩孕周、新生兒體重和新生兒長度有統計學差異，另外，GDM女性更有可能有糖尿病家族史，而兩組在每個妊娠期的年齡、BMI和孕周相似。表1 妊娠中晚期健康對照和GDM孕婦的臨床特徵比較
數據以平均值±標準差、中位數(四分位數範圍)或n(%)表示。NGT:正常血糖耐受，GDM:妊娠糖尿病，FBG:空腹血糖，1h-PG:餐後1小時血糖，2h-PG:餐後2小時血糖，LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇。
如代謝組學分析(圖1a, b)所示，PCA分析結果表明，在妊娠中期和晚期，病例組(GDM)與對照組(正常)沒有分布相離現象，此外，PLS-DA分析表明在兩個妊娠期都顯示出相對清晰的區分(圖1c, d)，最後，OPLS-DA(圖1e, f)用代謝產物豐度評價了GDM患者與正常對照組之間差異的可能性，結果表明，妊娠中期OPLS-DA模型的R2和Q2分別為0.347和0.165，妊娠晚期的R2和Q2分別為0.324和0.201，隨後，我們通過採用排列檢驗(n=200)驗證所建立的OPLS-DA模型的預測能力，由排列數據得到的R2和Q2值均低於原始值，表明OPLS-DA模型沒有擬合過。我們進一步採用OPLS-DA模型的VIP值（包括標準|log2FC|>0，p<0.05)來確定DEMs。火山圖提供了一種快速顯示正常孕婦與GDM患者代謝物表達水平差異的方法，具有統計學意義(圖2)。如火山圖所示，本研究發現的200個代謝物中，妊娠中期組有57個代謝物，妊娠晚期組有72個代謝物被認為是DEMs。妊娠中期組前5位的DEMs分別為3-甲基-2-氧戊酸、3-羥基丁酸、棕櫚酸、α -羥基異丁酸和乙酸，而妊娠晚期組中，分別為酮亮氨酸、α -酮異戊酸、丙酮酸、L-色氨酸和琥珀酸。多數DEMs在妊娠中期表達下調(圖2a)，而多數DEMs在妊娠晚期表達上調(圖2b)，提示不同妊娠階段的代謝組學功能障礙不同，氨基酸、脂肪酸和有機酸約占妊娠中期和晚期的70%(圖2e, f)。
a，妊娠中期的PCA分析。b，妊娠晚期PCA分析。c，妊娠中期的PLS-DA分析。d，妊娠晚期PLS-DA分析。e，妊娠中期的OPLS-DA分析。f，妊娠晚期OPLS-DA分析。妊娠中期，藍色為對照組，綠色為病例組。妊娠晚期,紫色為正常孕婦，紅色為GDM患者。
a，妊娠中期組DEMs火山圖。b，妊娠晚期組DEMs火山圖。c，妊娠中期組DEMs的檢驗統計。d，妊娠晚期組DEMs的檢驗統計。e，妊娠中期組DEMs的分類。f，妊娠晚期組DEMs的分類。
我們使用SMPDB富集分析評估了DEMs(圖3a,b)，妊娠中期組，α-亞麻酸和亞油酸代謝途徑富集倍數最高，p值最低(p<0.001)，FDR<0.1，其他重要功能包括極長鏈脂肪酸的氧化和纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸的降解(圖3a和表2)，而在妊娠晚期組中，尿素循環、氨循環、甘氨酸和絲氨酸代謝、纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸降解、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸代謝、穀氨酸代謝、天冬氨酸代謝、葡萄糖-丙氨酸循環、苯丙氨酸和酪氨酸代謝，以及肉鹼合成這些功能與相應的DEMs顯著相關(圖3b和表3)。另外，我們還通過通路分析研究了DEMs的功能，結果觀察到32條通路，其中9條在妊娠中期組顯著富集(圖3c)，其中，纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸生物合成和纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸降解兩個途徑在反映代謝物變化方面起着關鍵作用。對於妊娠晚期組，發現了48條通路，其中21條顯著富集了DEMs(圖3d)。此外，不同妊娠階段在功能和通路水平上也存在顯著差異(圖3)，提示應考慮階段特異性的生物標誌物和診斷模型。
a，妊娠中期組的DEMs進行功能富集。b，妊娠晚期組的DEMs進行功能富集。c，妊娠中期組的DEMs進行通路富集。d，妊娠晚期組的DEMs進行通路富集。
表中顯示p值< 0.05的途徑相關代謝物集。Total表示代謝物組中代謝物的總數;Hits代表在代謝物組中統計GDM患者代謝物的平均數量;Raw p:富集分析中原始p值;Holm p為經Holm- Bonferroni方法調整後的原始p值;FDR是錯誤發現率。
進行了組間代謝組學差異和功能富集分析後，有必要建立一個能預測孕婦是否存在GDM的診斷模型，並使用計算機算法確定潛在代謝物特徵的重要性。在妊娠中期組中，我們首先將70%的樣本設為訓練數據，30%的樣本設為測試數據，然後通過訓練數據學習RF模型以獲取每個代謝物的重要性得分，在此基礎上選擇重要性得分最高且與DEMs重疊度高的候選代謝生物標誌物。接着，在這類代謝生物標誌物的訓練數據上構建LR模型，訓練AUC為0.808。最後，在測試數據上對妊娠中期租特異性LR模型進行驗證，測試AUC為0.807（圖4a）。同樣，對妊娠晚期組，我們使用RF選擇代謝性生物標誌物，並建立LR模型，該模型對測試數據的學習性能AUC為0.819，驗證性能AUC為0.810（圖4b）。在實踐中，利用我們的新診斷方法診斷為陽性的患者實際患病概率約為30%，而GDM的患病率為11.91%。妊娠中期組陽性預測值為0.328，陰性預測值為0.964(敏感性和特異性均為0.783，為最佳診斷界限)，妊娠晚期組陽性預測值為0.269，陰性預測值為0.958(敏感度為0.767，特異度為0.717)。此外，幾乎所有識別的候選生物標誌物都是DEMs（表4）。值得注意的是，有三種常見的潛在代謝生物標誌物(3-羥基丁酸、異丁酸和異戊酸)在妊娠中期和晚期組中都發現了，隨着妊娠的發展，這三種代謝生物標誌物在正常孕婦中明顯增加，而在GDM患者中只有3-羥基丁酸增加，我們還用校準圖(圖4c, d)評估預測的概率和實際概率之間的擬合優度，評估了預測的概率值與實際概率的相似程度。
a，妊娠中期組的ROC曲線。b，妊娠晚期組的ROC曲線。c，妊娠中期組的校正圖。d，妊娠晚期組的校正圖。x軸表示每個十分位的平均預測概率值，y軸表示每個十分位對應的觀測概率值。誤差柱代表平均預測概率的95%置信區間。
最後，為了確定與GDM相關的代謝生物標誌物的臨床相關性，我們使用WGCNA來推斷代謝模塊與臨床指標之間的相關性。如圖5a所示，妊娠中期組檢測了四個模塊，藍綠色表示的模塊與GDM(即組指數)及許多其他重要的臨床指標，包括孕前BMI、OGTT、TC、TG和LDL顯著相關。此外，該模塊包含顯著變化的11個DEMs (P=9.99e−04)，而藍色模塊包含3個DEMs (P=0.666)，棕色模塊包含2個DEMs (P=0.580)，灰色模塊包含41個DEMs (P=0.868)(圖5c)。另外，在妊娠晚期組中檢測了五個代謝模塊(圖5b)，其中藍綠色模塊包含21個DEMs(P=6.737e−08)，藍色模塊包含5個DEMs (P=0.944)，棕色模塊包含6個DEMs (P=0.090)，灰色模塊包含37個DEMs (P=0.992)，黃色模塊包含3個DEMs (P=0.606)(圖5d)。另外，藍綠色模塊與組、OGTT、TC、TG和LDL相關，黃色模塊與組、孕前BMI和OGTT呈正相關。值得注意的是，候選生物標誌物幾乎都是DEMs (表4)，因此，它們對特定模塊及其與GDM的關聯有相似的貢獻。
a，WGCNA分析妊娠中期組代謝產物模塊及臨床指標。b，WGCNA分析妊娠晚期組代謝產物模塊及臨床指標。c，妊娠中期組代謝產物模塊中DEMs的分布。d，妊娠晚期組代謝產物模塊中DEMs的分布。
表4 妊娠中期和晚期與GDM相關的候選代謝生物標誌物
本研究採用UPLC-MS/MS進行代謝組學分析，獲得了正常孕婦和GDM患者代謝變化的詳細信息，並採用單因素和多因素統計分析進一步研究血清代謝物的變化。與健康孕婦相比，在妊娠中期組和妊娠晚期組發現的13個候選代謝物生物標誌物與GDM有關。根據代謝富集和途徑分析，妊娠中期組的纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸降解在兩種分析中均有一致性發現。在妊娠晚期，纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸的降解和甘氨酸、絲氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、穀氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸的代謝在兩項分析中都是一致的。RF模型發現了代謝生物標誌物，基於此建立的LR模型具有很高的預測效率，此外，這些生物標誌物與臨床指標具有顯著相關性。在我們的研究中，由纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸組成的BCAAs在GDM組中高於NGT組。雖然一些研究發現，BCAAs水平在GDM和NGT之間沒有顯著差異，但一些研究又表明，GDM患者中BCAAs的水平升高可能可作為GDM的生物標誌物。PI3K/Akt/mTOR信號通路參與蛋白質和脂質生物合成等功能，mTORC1受富集於腦(Rheb)和結節性硬化複合體(TSC)複合物(TSC1和TSC2)的小GTPase Ras同源物控制，當胰島素存在時，mTORC1激活胰島素受體和胰島素受體底物(insulin receptor substrate, IRS)，進而促進PI3K和Akt的激活。Akt抑制TSC複合物，使Rheb刺激mTORC1介導細胞功能。核糖體S6蛋白激酶1 (S6K1)是mTORC1底物之一，參與Rheb/mTOR/S6K通路。然而，Rheb/ mTOR/S6K通路的結構性激活可誘導負反饋，從而導致胰島素抵抗，BCAAs可能與GDM女性的胰島素抵抗相關,一種可能的機制是BCAAs水平升高導致mTOR/S6K1途徑的激活和IRS1絲氨酸磷酸化，有助於抑制胰島素誘導的PI3K激活和胰島素抵抗。此外，BCAA代謝異常可導致毒性BCAA代謝物的積累，導致β細胞線粒體功能障礙和對胰島素抵抗高度敏感。在我們的研究中，GDM組的甘氨酸和絲氨酸代謝水平較低，這與之前的研究結果一致。Takashina等觀察到空腹血糖和餐後2小時血糖水平或穩態模型評估胰島素抵抗，均與甘氨酸水平呈負相關，穩態模型評估β-細胞功能指數與甘氨酸和絲氨酸水平呈負相關。此外，已報道口服甘氨酸可增加胰島素分泌而不影響胰島素敏感性。另外，GDM組的精氨酸和脯氨酸水平也較低。據報道，精氨酸及其代謝產物可促進人胰島素分泌，改善胰島素抵抗。精氨酸對代謝異常有多種作用，但也可能誘發氧化應激。脯氨酸被吸收代謝為穀氨酰胺，穀氨酰胺進入三羧基循環，最終轉化為葡萄糖。一項研究表明，與單獨攝入葡萄糖相比，與葡萄糖一起攝入脯氨酸可減弱葡萄糖區域反應，但不影響胰島素反應，並降低胰高血糖素水平。α-亞麻酸是多不飽和脂肪酸的前體，多不飽和脂肪酸主要含有omega-6和omega-3脂肪酸。Zhong等人的一項meta分析調查了omega-3脂肪酸對GDM的療效，發現在GDM患者中補充omega-3脂肪酸可以降低FPG和HOMA-IR評分。Omega-3脂肪酸參與了增加脂肪酸β氧化，改善抗氧化功能和胰島素作用，以及減少脂肪生成的機制。短鏈脂肪酸(SCFAs)是指含有1到6個碳的脂肪酸，先前的研究表明，可通過增加游離脂肪酸受體-2的表達及其內源性配體SCFAs的改變來改善妊娠期間胰島素的分泌，並以此促進葡萄糖穩態。SCFAs還通過抑制腺苷脫氨酶/黃嘌呤氧化酶途徑來減少妊娠晚期的雄激素過剩，從而保護胎兒免受糖代謝紊亂和不良胎兒結局的影響。SCFAs不僅影響代謝，還影響心血管疾病。短鏈脂肪酸可被G蛋白偶聯受體識別，其中代表為G蛋白偶聯受體41(Gpr41)。另一SCFA受體——嗅覺受體78，與Gpr41共同參與調節血壓，Gpr41降低基線血壓，嗅覺受體78誘導SCFAs的高血壓效應。在我們的研究中，醋酸鹽，主要的SCFAs之一，在GDM患者中降低。人們認為它通過激活AMP激活的蛋白激酶來增強糖的攝入和脂質代謝，此外，補充醋酸鹽可顯著增加激活的Treg細胞的數量，這可以減輕高血壓/血管緊張素II誘導的心臟損傷，包括心肌肥厚和纖維化，並改善心肌電重構。值得注意的是，3-羥基丁酸被選為兩個妊娠組的潛在代謝生物標誌物。作為一種典型的酮體，3-羥基丁酸的水平由於游離脂肪酸的氧化和過量的乙酰輔酶a而增加。脂肪酸和碳水化合物氧化產生的ATP失去控制，導致乙酰輔酶a水平增加。一項對糖尿病大鼠的研究表明，葡萄糖的低效利用和動員可能導致3-羥基丁酸水平的升高。在WGCNA分析中，兩個妊娠期的灰色模塊中都包含肉鹼。既往研究表明，2 g/d L -肉鹼可降低TC和LDL，其機制可能與胰島素抵抗和脂毒現象有關，然而，較高劑量的L -肉鹼有不同的作用，因為它促進TG、載脂蛋白- a1和載脂蛋白-b100水平升高。妊娠中期組BCAAs在灰色模塊，妊娠晚期組異亮氨酸在灰色模塊，妊娠晚期組亮氨酸和纈氨酸在藍綠色模塊。人們普遍認為，BCAAs轉氨酶有助於異亮氨酸和纈氨酸轉化為支鏈α-酮酸，後者通過支鏈α-酮酸脫氫酶複合物進一步轉化為丙酰基輔酶a，丙酰基輔酶a可與相應的羧化酶結合形成甲基丙酰基輔酶a。甲基丙二酰輔酶a (MUT)是一種催化甲基丙二酰輔酶a轉化為琥珀酰輔酶a的酶。根據小鼠實驗，Mut表達降低導致體重增加、高胰島素血症、空腹血糖升高和甘油三酯升高。事實上，這項研究存在一些局限性。首先，在橫斷面研究設計中，代謝物只在一個點上進行了測量，因此，需要進一步的前瞻性隊列研究來建立這些代謝物與GDM的動態關聯。第二，雖然前三個月的代謝生物標記物有助於早期診斷和及時干預，但由於前三個月缺乏足夠的參與者，我們主要關注了中、晚期的代謝變化。第三，妊娠中期是從妊娠14周開始並持續到27周結束，妊娠中期組從24周開始招募，到27周招募結束，因此，重要的信息可能被遺漏了。第四，GDM發展的確切分子機制尚不清楚，需要進行機制研究，以明確這些已發現的代謝物在GDM中的確切作用。總之，通過對血清樣本的分析，我們的研究表明了GDM患者存在特定的代謝組學特徵，一些關鍵的代謝物，如甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸和3-羥基丁酸，與妊娠中期或晚期的GDM相關，並且已經確定了潛在的GDM生物標誌物。這些代謝物主要參與脂肪酸和氨基酸的代謝，可能對GDM的病理有一定的啟示，然而，我們需要進一步的研究來證實我們的發現，並探索潛在的分子機制。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8379750/王寧利教授：80%眼病可防可治，建議將眼健康管理納入慢病管理系統
單細胞分析代碼（2）-任意細胞亞群的差異分析取
留言列表