鑽石舞台

iMeta |膳食甘草促進小鼠鎘解毒並調節腸道菌群代謝

https://doi.org/10.1002/imt2.7

引 言

由於歷史原因和工業化發展，當今人們容易接觸過量的重金屬鎘。鎘污染源主要包括大氣沉降、污染地區水源和食物、以及吸煙等。在中國，官方數據顯示全國19.4%的被調查地塊都存在污染，其中鎘污染占到了總污染的7%。同樣，調查顯示從2005年到2012年，市場上約有14%的農作物產品都存在重金屬污染。在我國部分地區，尤其是礦區關聯地區，近年來人群鎘濃度超標的案例不在少數。在一些大尺度抽樣調查分析中，一些兒童甚至有血鎘濃度超標。針對這種案例的醫學干預手段效果往往難以評估。在面對已經存在的血鎘超標情況時，當前難以實現快速有效的處理。原因主要包括這四個方面：污染源難以精確識別，責任追溯難以界定，作為一種慢性中毒醫學干預難以實施，針對性治療藥物難以獲得。那麼我們應當如何解決體內鎘超標問題呢？

對大規模群體的健康干預最好的方法就是對其膳食進行干預。近年來，膳食干預已經被用於預防和治療阿爾茨海默症、子宮內膜異位症、兒童肥胖症、急性淋巴細胞白血病、心血管疾病、抑鬱症和Ⅱ型糖尿病。例如，研究者們利用茶葉提取物通過抑制乙酰膽鹼酯酶活性來預防阿爾茨海默症。最近，人們發現飲食添加甘露糖是治療女性急性尿路感染，及小鼠關節炎、免疫疾病、腫瘤的一種潛在療法。

因此我們認為，傳統的中草藥膳食可用於大規模鎘中毒相關人群健康的干預中。與西藥相比，可食用中草藥具有低毒副作用、價格低廉、易於獲取等優點。例如，甘草是使用最廣泛使用的中草藥，並且與其他藥物一起使用可以調節免疫系統。甘草中的天然成分不僅可以用於治療慢性病毒性肝炎，還可以作為甜味劑被用作食品添加劑，目前還被美國食品和藥品管理局批准用於化妝品。

結 果

篩選對小鼠急性鎘中毒有解毒作用的膳食中草藥

我們首先通過動物實驗初步篩選了具有解毒效果的中國傳統草藥膳食（圖1）。在鎘中毒小鼠模型中，我們初步評估了5種候選藥膳食材（甘草、洋蔥、小茴香、生薑、花椒）製成的飼料。在為期一個月的膳食干預期，每隻小鼠約攝入110.97–131.68克食物，體脂含量從21.03克增加到25.78克，體重增加了−0.20至3.24克。六個處理之間的食物攝入和體重增長沒有顯著差異。與對照組相比，甘草、洋蔥、茴香和生薑的血鎘含量都有降低，但甘草組降低的最多，超過了50%（圖1）。這些結果表明，甘草能有效緩解小鼠的急性鎘中毒。

圖1 篩選鎘解毒功能膳食草藥的流程

將小鼠隨機分成六組，腹腔注射鎘溶液。通過給鎘中毒小鼠餵食混合了草藥提取物（FE：小茴香提取物；GE：姜提取物；LE：甘草提取物；OE：洋蔥提取物；PE：胡椒提取物）的食物，進行為期1個月的膳食干預。測量血鎘濃度（平均值±標準偏差，n=3，*P < 0.05，t檢驗），以評估膳食干預對鎘的解毒作用。

甘草對小鼠急性鎘中毒的解毒效果

為進一步評估膳食甘草的解毒效果，設置四個小鼠處理組：對照、鎘、甘草、鎘+甘草（圖2A）。我們發現為期1個月的甘草膳食干預沒有顯著影響小鼠的體重和食物攝取（圖2CD）。鎘中毒小鼠的體重略有增加，兩個無鎘處理之間沒有顯著差異（圖2C）。與無鎘處理相比，鎘中毒顯著增加了小鼠的食物攝入量，但與對照組相比，膳食甘草的食物攝取量沒有顯著變化（圖2D）。在干預第28天時，膳食甘草干預的血鎘含量顯著降低了52.8%，心臟鎘降低66.7%，肺鎘降低40.6%，同時增加了鎘在肝臟和腎臟中的積累（圖2E）。我們推測甘草膳食干預顯著增強了肝臟和腎臟對鎘的代謝，從而導致了其他組織器官內的鎘被快速清除。組織學檢測表明膳食甘草緩解了鎘對肝細胞的損傷。肝功能檢測結果也表明甘草膳食干預改善了鎘中毒小鼠的肝功能（圖2F）。

圖2 甘草對體內鎘的解毒作用

將小鼠隨機分為四組（對照組、甘草組、鎘組和鎘+甘草組），並按照實驗設計和時間線的示意圖進行不同的處理（A）。NF：普通食物；NS：生理鹽水；i.p.：腹腔注射。（B–D）測量體重變化（平均值±標準差）、體重增加和總食物攝入量（平均值±標準差），以評估處理後的生存情況（n=8，字母表示P<0.05，方差分析）。（E）測定血液、心臟、肺、肝臟和腎臟中的鎘濃度（平均值±標準差，n=6，*P<0.05，t檢驗）。（F）對肝臟和腎臟進行了組織病理學評價，此處只展示具有代表性的圖像。標尺代表100μm。ANOVA：方差分析；LE：甘草提取物

急性鎘中毒和甘草膳食干預下的肝細胞活性測試和金屬硫蛋白基因（Mt）表達

高效液相色譜（HPLC）分析甘草提取物成分發現，甘草含有20多種三萜和300多種黃酮（圖3A）。其中有6種最主要的甘草活性成分，甘草苷含量為5.2%，甘草酸含量為17.7%（圖3A）。細胞實驗表明，6.4 mg/mL的甘草提取物沒有造成小鼠肝細胞活力降低，這說明我們的提取物相對安全（圖3B）。甘草提取物可以顯著降低培養基中游離鎘，顯著增加肝細胞中的鎘積累，這與動物實驗結果一致（圖3CD）。此外，細胞和動物實驗表明，甘草及代謝衍生物甘草次酸顯著激活肝金屬硫蛋白基因的表達，該基因是鎘代謝關鍵基因（圖3EF）。基於這些結果，我們認為甘草提取物中的衍生代謝物甘草次酸是發揮解毒作用的主效成分。

圖3 甘草水提物指紋圖譜分析及甘草和鎘對肝細胞毒性的體內試驗

（A）HPLC指紋圖譜顯示甘草提取物的主要化學成分。（B）使用小鼠細胞系AML12進行甘草提取物濃度梯度的細胞活力測試。用甘草提取物處理鎘暴露的AML12細胞24小時，並測定（C）培養基和（D）細胞中的鎘含量（平均值±標準差，n=3，*P<0.05，t檢驗）。（E）暴露於鎘中的AML12細胞用甘草酸和甘草次酸處理12小時，並使用qPCR分析Mt1基因（n=3）的表達水平。（F）在飲食甘草干預4周後，通過qPCR分析確定肝組織（n=6）中Mt1基因的表達水平。HPLC：高效液相色譜法；LE：甘草提取物；qPCR：熒光定量聚合酶鏈反應。

甘草膳食對腸道菌群的影響

膳食甘草干預首先影響了腸道微生物，微生物的代謝是甘草藥效發揮的關鍵過程。為了評估這種過程，我們接下來進行了腸道微生物宏基因組學分析。菌群α多樣性表明，甘草膳食干預顯著降低了腸道微生物的多樣性，而鎘處理並沒有（圖4A）。主坐標分析（PCoA）顯示，由於甘草的攝入，4個處理的腸道微生物群落被分為了兩個集，鎘和對照集，以及甘草和鎘+甘草組（圖4B）。LDA分析表明甘草膳食干預顯著富集了副擬桿菌（圖4C）。我們鑑定出18個豐度變化最大的關鍵腸道微生物，其中狄氏副擬桿菌的相對富集豐度最大（圖4D）。已有實驗證據表明該菌的有益功能包括改善宿主的脂類代謝、調節膽汁酸代謝等。而微生物代謝功能分析表明，甘草膳食干預促進了氨基酸和膽汁酸代謝通路（圖4E），同時使糖苷水解酶基因豐度增加（圖4F）。由於糖苷水解酶可以轉化甘草有效成分甘草次酸，因此我們認為腸道微生物的生物轉化增加了甘草的藥效。

圖4 膳食甘草改變了鎘中毒小鼠的腸道微生物組成和功能

（A）使用Shannon指數分析四個處理中腸道微生物群的α多樣性。（B）四個處理中腸道宏基因組物種的主成分分析。（C）通過線性判別分析（LDA）效應大小（LDA值>3.0）分析鎘和鎘+甘草處理之間豐度差異的腸道微生物種類。（D）通過分析注釋到種的微生物、豐度在前500的微生物以及鎘和鎘+甘草處理之間豐度差異的腸道微生物之間的重疊群，篩選鎘和鎘+甘草處理之間主要的豐度差異腸道微生物；熱圖顯示鎘和鎘+甘草處理組中18個選定物種的豐度。（E）鎘和鎘+甘草處理組中KEGG代謝途徑的線性判別分析。（F） 由CAZy數據庫注釋的鎘和鎘+甘草處理組之間豐度差異的碳水化合物活性酶（CAZy）基因。LE：甘草提取物

甘草膳食對腸道代謝產物的影響

宏基因組分析表明，在膳食甘草的驅動下，腸道微生物群落及其代謝功能發生了顯著變化。為了研究這些變化是否影響腸道代謝，我們對新鮮糞便進行了代謝組學分析。主坐標分析結果顯示，甘草膳食干預顯著改變了腸道代謝物構成（圖5AB）。相比之下，鎘中毒的小鼠糞便中只觀察到輕微的代謝物構成變化（圖5AB），這與前面腸道宏基因組的分析結果一致。在鎘組與鎘+甘草組差異代謝物中，有176個代謝物被注釋（圖5C）。其中植物源代謝物所占比例最大。我們將前面提到的18個關鍵腸道微生物和top50的差異代謝物進行了相關性分析（圖5D）。有兩個明顯的簇呈現出了整體的相關性，其中右側一簇包含甘草源代謝物，它們與被富集的菌呈顯著正相關。左側一簇包含多個與疾病與炎症相關的代謝物，它們與絕大多數被抑制的菌呈現顯著正相關。值得注意的是，L型酪氨酸，在先前的研究中被認為是長期鎘暴露的分子標誌物，與絕大多數被富集的菌呈現顯著的負相關性。以上這些結果暗示膳食甘草干預促進了小鼠健康。

圖5 鎘和鎘+甘草組之間的代謝物差異，以及腸道代謝物和差異腸道微生物之間的相關性

正（A）和負（B）離子代謝物的偏最小二乘鑑別分析（PLS-DA）。（C）鎘和鎘+甘草之間豐度有差異的代謝物。（D）鎘和鎘+甘草組中18種關鍵豐度有差異的微生物與前50個豐度差異代謝物之間的相關性。正相關性以紅色顯示，而負相關性以藍色標記。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。LE：甘草提取物

討 論

膳食甘草的鎘解毒效應

本研究中選擇的使用草藥在中國通常用作食品或調味劑，並且有着悠久的歷史。甘草、洋蔥和生薑在中國藥典《中華人民共和國藥典》和《中藥》中通常用於解毒。但在這三種草藥中，只有甘草僅在一個月的時間裡就對小鼠表現出顯著的鎘解毒作用。從現代醫學的角度來看，「解毒」是一個寬泛的概念，涵蓋有毒物質的解毒，也包括緩解各種炎症疾病，如喉嚨痛、發燒和口腔潰瘍。我們的研究結果表明，傳統的「解毒」中藥在減輕小鼠鎘中毒方面效果並不明顯，因此我們認為傳統的「解毒」概念不能簡單地用於現代醫學中的金屬解毒。

大量研究表明，甘草在治療肝病和重金屬中毒中都表現出了較好的效果。而本研究首次報道了甘草對小鼠多組織中鎘的清除作用。鎘在小鼠組織中的積累依賴於攝入量，過量的攝入可能導致組織中鎘的快速超載。在這項研究中，我們使用腹腔鎘注射快速形成急性鎘中毒小鼠，該劑量既能夠產生明顯毒性現象且肝臟中沒有明顯的組織粘連，體重或食物攝入也沒有顯著減少。在哺乳動物中，物質交換和營養傳遞中的血液流動與循環對鎘在不同組織間的運輸和再分配中起着重要作用。之前的幾項研究已經證實了血液中鎘含量與身體所承受的鎘負荷之間有較強的相關性。因此，血液中的鎘含量可以指示鎘毒性的水平。以血鎘為指標，甘草是五種備選草藥中唯一一種在1個月內就明顯降低血鎘含量草藥（圖1）。

膳食甘草促進了肝臟中鎘的穩定性，這可能是導致血液、心臟和肺中鎘被清除的原因。過去幾十年的研究表明，人體內主要的鎘儲存庫是肝臟和腎臟；大多數鎘離子首先被MTs捕獲，在肝細胞中形成鎘-MT複合物。少量的鎘-MT可以從肝臟釋放到血液中，然後緩慢地釋放到腎臟，腎臟中的鎘主要通過尿液排出。因此，對於小鼠的鎘解毒來說，在肝臟和腎臟中積累鎘是必不可少的過程。我們的小鼠實驗和體外實驗都表明，膳食甘草增加了肝臟和腎臟中的鎘積累（圖2）。Mt1基因基本上由甘草提取物，尤其是甘草次酸誘導。本研究中甘草次酸對小鼠肝臟Mt基因的顯著誘導表明，甘草藥效的激發依賴於腸道微生物將甘草酸轉化為甘草次酸。綜上所述，膳食甘草對鎘暴露後的小鼠健康有益

膳食甘草調節腸道菌群

甘草的化學成分包括三萜、類黃酮以及各種多糖。我們的HPLC分析檢測到了甘草中所有的常見成分，其中甘草酸的含量最高（圖3）。眾所周知，甘草酸主要通過腸道菌群轉化為甘草次酸後才具有藥理作用，而我們在糞便代謝組發現了大量的甘草次酸。近年來，人們發現腸道微生物在幫助宿主代謝草藥中發揮了重要的作用，例如微生物對皂甙的去糖基化。事實上，我們也觀察到宏基因組組合中幾個GH家族的豐度顯著增加，包括GH15和GH30（圖4F），它們可能有助於甘草酸的去糖基化。此外，18個關鍵腸道微生物與甘草中的五種三萜呈正相關（圖5D），這表明小鼠腸道菌群可能對膳食甘草的代謝及其藥物效應的產生有着重要影響。而我們的研究還顯示單獨使用鎘不會導致腸道微生物結構或糞便代謝組發生顯著變化，但卻對肝臟組織產生明顯的毒理學效應。這可能是由於，甘草是通過口服攝入而直接影響腸道菌群，相比較腹腔注射的鎘會對腸道菌群產生更大影響。儘管如此，鎘還是對腸道菌群產生了一些影響，如與健康相關的乳酸桿菌科和乳酸桿菌受到了抑制。甘草除了會引起的菌群的多樣性降低外還對微生物群落結構產生了顯著影響，例如，包括類桿菌和類副桿菌屬在內的一些對健康有益的菌群得到了富集，尤其是狄氏副擬桿菌。另一種細菌，Bacteroides gordonii也在膳食甘草組被富集（圖4D），據報道其可以緩解肥胖和類風濕性關節炎等疾病。儘管如此，甘草攝入引起的腸道菌群變化是否是甘草的一般健康效應目前尚不清楚，儘管目前的研究結果表明膳食甘草可以減少血液中的鎘含量，減輕鎘對宿主健康的傷害。

膳食甘草調節小鼠腸道代謝

幾種已被確定為環境鎘長期暴露的潛在生物標記（例如，L-穀氨酰胺、L-酪氨酸和黃嘌呤），在鎘+甘草治療組中的豐度顯著降低。可能與慢性炎症、慢性肝病和過氧化物酶體疾病有關的7α-OH-DHEA、D-哌啶酸和3-羥基十二烷二酸與18種關鍵腸道細菌之間存在顯著負相關（圖5D）。通過整合功能基因豐度信息和代謝物豐度信息，我們重構了主要的受膳食甘草干預調節的腸道微生物代謝通路（圖6）。其中最主要的是膽汁酸代謝通路。我們認為初級膽酸，如牛磺脫氧膽酸（TUDCA）和牛磺-β-鼠膽酸（T-β-MCA），通過膽酸解結合基因bsh等基因代謝，轉化成了次級膽酸，如12-酮脫氧膽酸和脫氧膽酸（DCA）（圖6B）。這一推論與前面的腸道菌功能富集分析和肝臟膽酸水平測定結果相吻合。由於次級膽酸可以調節肝臟的膽酸合成，進而影響腸道群落構成與腸道免疫，並調節宿主的脂肪酸代謝，因此我們認為甘草膳食干預對鎘中毒小鼠的腸道健康具有促進作用。我們檢測到多種氨基酸代謝酶的編碼基因，尤其是arg和glnA，它們在鎘+甘草組中大量富集（圖6D）。因此我們推測，在鎘組和鎘+甘草組之間未觀察到食物攝入量變化的原因是，膳食甘草促進了氨基酸（如酪氨酸和穀氨酸）發酵成短鏈脂肪酸。

圖6 與膳食甘草干預相關的腸道菌群的關鍵代謝產物和潛在代謝途徑

（A）熱圖顯示了鎘和鎘+甘草組的差異代謝物（P<0.05）。圖中顯示了前10種豐度高的甘草衍生代謝物和腸道代謝物。（B–D）代表性代謝物、相關酶編碼基因和相關代謝途徑。這些途徑是基於KEGG代謝圖譜構建的。代謝物顯示為紅色：富集於鎘+甘草組；藍色：富集於鎘組；黑色：未檢測到。本研究檢測到的微生物酶編碼基因用方框表示（虛線表示豐度較低）。虛線箭頭表示未檢測到相關酶編碼基因的潛在代謝過程。相關代謝物（平均值±標準差，n=6，*P<0.05，**P<0.01，t檢驗）和基因（平均值±標準差，n=3，*P<0.05，**P<0.01，t檢驗）的相對豐度如圖所示。DCA：脫氧膽酸；LE：甘草提取物；TUDCA：牛磺尿脫氧膽酸；T-β-MCA：牛磺酸-β-鼠膽酸。

總 結

總的來說，飲食甘草改變了小鼠腸道微生物多樣性，增加狄氏副擬桿菌豐度，富集了糖苷水解酶基因和膽汁酸代謝途徑。甘草酸通過腸道菌群積極轉化為甘草次酸，隨後被轉移到肝臟，通過誘導金屬硫蛋白表達，減輕鎘引發的肝損傷。肝臟和腸道可能通過膽汁酸相互作用，影響腸道微生物組結構。由於肝臟中的鎘積累，其他組織中的鎘濃度降低（圖7）。

圖7 在鎘脅迫下膳食甘草干預對小鼠健康調節機制示意圖

膳食甘草改變了小鼠腸道微生物群的多樣性，增加了狄氏副擬桿菌的豐度，並富集了糖苷水解酶（GH）基因和膽汁酸代謝途徑。甘草酸被腸道菌群積極轉化為甘草次酸。從組織病理學分析和肝功能方面來看，甘草次酸通過快速誘導Mt1基因表達，被轉移到肝臟中，減輕鎘引起的肝損傷。肝臟和腸道可能通過膽汁酸相互作用，影響腸道微生物群結構。由於肝臟中的鎘積累，其他組織中的鎘積累減少。

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「iMeta」 是由威立、腸菌分會和本領域數百位華人科學家合作出版的開放獲取期刊，主編由中科院微生物所劉雙江研究員和荷蘭格羅寧根大學傅靜遠教授擔任。目的是發表原創研究、方法和綜述以促進宏基因組學、微生物組和生物信息學發展。目標是發表前10%(IF > 15)的高影響力論文。期刊特色包括視頻投稿、可重複分析、圖片打磨、青年編委、前3年免出版費、50萬用戶的社交媒體宣傳等。2022年2月正式創刊發行！

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