ACS美國化學會 - ACS Chem. Biol. │ 通過調控酪蛋白激酶2α中的O‑GlcNAc修飾改變磷酸化蛋白質組－鑽石舞台

英文原題：Writing and Erasing O‑GlcNAc on Casein Kinase 2 Alpha Alters the Phosphoproteome

通訊作者：Christina M. Woo 哈佛大學

供稿人：黃宗煜北京大學

大家好，本周為大家介紹一篇ACS Chemical Biology的文章，標題為「Writing and Erasing O‑GlcNAc on Casein Kinase 2 Alpha Alters the Phosphoproteome」。文章的通訊作者是來哈佛大學化學與化學生物學系的Christina M. Woo教授。

O連接的N乙酰化葡萄糖胺（O-GlcNAc）是一種在絲氨酸和蘇氨酸殘基中發現的單糖基化修飾。這種修飾幾乎分布在細胞內的所有區域，包括細胞核、細胞質基質以及線粒體等。該修飾在蛋白質中的引入和去除分別依賴於O-GlcNAc轉移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和O-GlcNAc水解酶（O-GlcNAcase，OGA）。目前，O-GlcNAc修飾和磷酸化翻譯後修飾之間的關係受到了研究者的廣泛關注，其中，O-GlcNAc修飾能夠與磷酸化翻譯後修飾共同調節細胞信號通路，此外，一些激酶中的O-GlcNAc修飾能夠通過影響激酶的功能調控某些蛋白質中的磷酸化修飾。

此前的研究表明，酪蛋白激酶2α（Casein Kinase 2 Alpha，CK2α）是酪蛋白激酶2（Casein Kinase 2）中的催化亞基，能夠通過位於其中的O-GlcNAc修飾執行相應的功能，但是人們目前還不清楚CK2α中的O-GlcNAc修飾對磷酸化蛋白質組的影響。本文的作者在先前的工作中將靶向識別某些蛋白質的納米抗體與OGT（nanobody-OGT）或OGA（nanobody-splitOGA）結合，並選擇性地在這些蛋白質中引入或去除O-GlcNAc修飾，進而調控其功能。在本文中，作者利用這一策略在CK2α中引入或去除O-GlcNAc修飾，並研究位於CK2α中的O-GlcNAc修飾對磷酸化蛋白質組的影響。

首先，作者同時在HEK293T細胞中過表達CK2α以及nanobody-OGT或nanobody-splitOGA（如圖1所示）。隨後，他們通過特異性富集EPEA標籤捕獲在細胞中過表達的CK2α，並利用Western blot檢測位於其中的O-GlcNAc修飾。結果表明，只有當nanobody-OGT或nanobody-splitOGA能夠靶向識別CK2α時，O-GlcNAc修飾才能夠特異地在CK2α中引入或去除。除此之外，與廣譜的OGA、OGT抑制劑Thiamet G和OMSI-4b相比， nanobody-OGT和nanobody-splitOGA對O-GlcNAc修飾在CK2α中的引入和去除影響更加顯著。這些結果表明，利用nanobody-OGT與nanobody-splitOGA能夠選擇性地實現O-GlcNAc修飾在CK2α中的引入和去除。

圖1 O-GlcNAc修飾在CK2α中的引入與去除

此前的研究表明，CK2α中的O-GlcNAc修飾主要位於347位的絲氨酸上，但是與其相鄰的348位絲氨酸也有一定的可能被O-GlcNAc修飾。隨後，作者通過對347位和348位絲氨酸進行定點突變檢測CK2α中O-GlcNAc修飾的具體位點（如圖2所示）。結果表明，當347位的絲氨酸突變為丙氨酸時，O-GlcNAc修飾不能被nanobody-OGT順利引入，而348位的突變對結果沒有任何影響，因此CK2α中的大多數O-GlcNAc修飾位於347位的絲氨酸。在此前的一些工作中，研究人員將能夠被O-GlcNAc修飾的絲氨酸位點突變為半胱氨酸，從而專門研究OGT在這些位點上引入O-GlcNAc修飾的效果，因為一般來說，OGT能夠在半胱氨酸上引入O-GlcNAc修飾，而位於半胱氨酸上的O-GlcNAc修飾不能被OGA識別。而在本文中，作者將347位絲氨酸突變為半胱氨酸，並嘗試利用nanobody-OGT在該位點引入O-GlcNAc修飾。隨後他們通過酶法標記在O-GlcNAc修飾上引入生物素（biotin）標籤，利用鏈霉親和素（streptavidin）富集含有O-GlcNAc修飾的CK2α，並通過與CK2α相連的FLAG標籤對其進行檢測。結果表明347位的半胱氨酸不能被nanobody-OGT引入O-GlcNAc修飾。因此，以上這些結果證明了本文所採用的策略在O-GlcNAc修飾研究中的可靠性。

圖2 CK2α中的O-GlcNAc修飾位點位於347位絲氨酸

隨後，作者在HEK293T細胞中過表達CK2α，利用nanobody-OGT或nanobody-splitOGA在CK2α中引入或去除O-GlcNAc修飾，並通過質譜檢測磷酸化蛋白質組的變化，帶有磷酸化修飾的蛋白質可以利用TiO2載體進行富集（如圖3所示）。由於CK2α中本底的O-GlcNAc修飾豐度很低，nanobody-splitOGA對O-GlcNAc修飾的影響較小，因此作者最終在利用nanobody-OGT引入O-GlcNAc修飾的實驗組中鑑定到了更多磷酸化蛋白質。一些富集程度較高磷酸化蛋白質均和CK2α中的O-GlcNAc修飾有關。

圖3 CK2α中的O-GlcNAc修飾位影響磷酸化蛋白質組

除此之外，大部分和CK2α中的O-GlcNAc修飾有關的磷酸化位點都是在利用nanobody-OGT引入O-GlcNAc修飾的實驗組中檢測到的，並且這些磷酸化位點的富集程度均相對較高（如圖4所示）。因此，以上這些結果再次驗證了nanobody-OGT與nanobody-splitOGA在研究O-GlcNAc修飾如何影響磷酸化蛋白質組中的價值。

圖4 CK2α中的O-GlcNAc修飾位影響磷酸化位點

總而言之，本文的作者利用與納米抗體結合的O-GlcNAc修飾酶與去修飾酶調控特定蛋白質中的O-GlcNAc修飾，並檢測目標蛋白質中的O-GlcNAc修飾對磷酸化蛋白質組的影響。他們以一個較為簡單的激酶CK2α為模型驗證了這一策略的可靠性，日後這一策略很可能被拓展至其他O-GlcNAc修飾的研究中，從而進行更加深入的探索。

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