鑽石舞台

原文作者：Michael Eisenstein

有什麼能比得上夏日裡一顆極甜美的草莓呢？可惜，市面上很多草莓都中看不中吃。不過，中國科學院遺傳與發育生物學研究所植物學家分子生物學家高彩霞及其團隊開創了一種方法，只需要幾處簡單的基因微調，就可以調控草莓的甜度[1]。高彩霞介紹道：「我們可以把每克草莓的含糖量增至20~41毫克，還可以種出多種甜度的草莓，任君選擇。」

包括高彩霞團隊在內，越來越多的研究團隊正在採用鹼基編輯（base editing）和先導編輯（prime editing）技術，力圖提高商品糧和商品果蔬作物的產量、抗病蟲害能力和對消費者的吸引力。這兩種編輯法都是基於廣為使用的CRISPR–Cas9系統改良的，利用該系統，可讓作物DNA的特定部分發生特定變化。由此，科學家可以進行諸多操作，如微調某種蛋白質的氨基酸序列，以及對決定某一基因表現度的序列進行更改。

生物醫學研究者已在爭相利用這些技術，研究（也許還可修復）各種與遺傳疾病相關的突變。種出更甜的草莓或許乍一看沒什麼了不起；但正是這一技術，正被用於培育抗病性更強、營養更豐富、單株產量更高的作物。

最重要的是，這些基因編輯系統的前景令人神往：有朝一日，它們或許能成為轉基因生物（GMO）培育技術之外的又一選擇——目前，人為添加外來基因的轉基因生物仍然備受公眾質疑，並經受密切監管和審查。中國科學院上海植物逆境生物學研究中心主任朱健康說：「轉基因生物攜帶了其它物種的外來基因，但基因編輯作物不必引入任何外來基因，只要微調其既有基因即可。」未來幾年內，市場將會迎來第一批基因編輯水果、蔬菜和糧食；但要規律產出作物，成功順應和滿足全球對農產品的大量需求，朱健康和其他植物學家同行還有很多工作要做。

在CRISPR編輯中，科學家將一種名為Cas9的酶導向基因組的固定位點，隨後Cas9會在此附着並修剪DNA的雙鏈。這個靶向過程由一個引導RNA完成，它會在DNA中找出一個匹配序列。

Cas9切割DNA後，細胞會通過非同源末端連接機制修復損傷之處。該修復過程往往會在切割端隨機插入或刪除鹼基對，進而打亂目標基因的功能。美國馬里蘭大學帕克分校的植物學家戚益平說：「這個方法很高效，但不夠精準。用它敲除基因容易，但未必能得到很多符合預期的效果。」如果目標不僅僅是阻止一個基因的自然發展，還要優化其功能，那麼，不可預測性會是個大問題。

2016年，美國哈佛大學化學生物學家劉如謙（David Liu）的團隊找到了一個解決辦法[2]。他們將改造過的Cas9注入胞苷脫氨酶，改變了一個胞苷鹼基的化學構成，將一個C–G鹼基對轉化成了T–A鹼基對，該過程稱為胞苷鹼基編輯。

2017年，劉如謙團隊又開發了一種腺嘌呤鹼基編輯器，用於將A–T鹼基對轉化為C–G鹼基對[3]，之後又有數十種胞嘧啶鹼基編輯器和腺嘌呤鹼基編輯器問世。該編輯技術的應用場景從哺乳動物細胞遷移到植物細胞後，效果奇佳，只需略作改動，即能最大限度地提升各種基因編輯技術的效率和精準度。雖然成功率因目標基因和植物物種不同差異很大，但最高達到了100%。

2019年，法國科學家採用了一種胞嘧啶鹼基編輯器，在基因eIF4E1中創造了一個單核苷酸變化，該基因編碼的一種蛋白質，能夠協助RNA轉化為各種蛋白質[4]。法國國家農業食品與環境研究院（INRAE）凡爾賽研究中心的植物遺傳學家Fabien Nogué參與了此項研究，他介紹道：「有些病毒也會用這種蛋白質完成自身的複製循環。」只要做一處編輯，就足以讓擬南芥（ Arabidopsis thaliana ）對苜蓿黃脈病毒這種常見植物病原體基本免疫。

同年，高彩霞團隊利用鹼基編輯，在小麥基因組的兩個位點引入點突變，使小麥具備了抵禦多種除草劑的能力[5]。

研究者甚至還可以開展「定向進化」實驗，將隨機發生的突變植入各種基因，進而發現提升植株某種特定性狀的新變體。例如，2020年，高彩霞和同事運用了結合胞嘧啶和腺嘌呤鹼基編輯的編輯系統，製造了一個水稻基因的變體，使水稻具備了對乙酰輔酶A羧化酶抑制劑類除草劑的抗藥性[6]。高彩霞說：「編輯的目標範圍有400個氨基酸，所以我們設計了200個引導RNA，完全涵蓋了這個範圍。然後我們噴灑除草劑，篩查這些基因突變的植株，看哪些能存活下來。」由此即可篩選出既能抵禦除草劑，又不影響植株自身健康的突變了。

鹼基編輯雖然神通廣大，但用武之地並不多。在12種可能的鹼基對變化中，只有4種能準確地實現。雖然科學家開發出了數種將胞嘧啶轉為鳥嘌呤的鹼基編輯器，但是，據團隊2021年的估算，這些編輯器總的來說不怎麼夠用[7]。戚益平說它們「缺乏效率」，認為「在改善效果方面，尚存有待跨越的知識鴻溝」。

此外，鹼基編輯也不適用於在單個基因里進行較大的改造，例如增刪較長的基因片段。要進行此類改造，可以利用傳統的CRISPR–Cas9，進行同源定向修復。由此，在Cas9進行切割的一端，細胞會吸納一條載有預期序列變化的植入DNA。但是，這一方法用於植物時，效率仍然不高。德國卡爾斯魯厄理工學院的植物生化學家Holger Puchta說：「在最理想的情況下，效率也就5%。」

2019年，劉如謙團隊提出了另一種基於CRISPR的替代策略，稱為先導編輯[8]。與鹼基編輯類似，先導編輯採用改造過的Cas9蛋白質進行單鏈切割，但是Cas9不再與核苷酸修飾酶結合，而是與一種逆轉錄酶結合。此外，先導編輯還採用了專門設計的引導RNA（即pegRNA），不僅能將編輯機制靶向定位至基因組中的準確位點，還包含了一個模板序列和一個引物結合序列，其中模板序例編碼了預期的基因組序列變化。DNA被切割後，引物與DNA在切口處結合，以此為落腳點，逆轉錄過程將RNA模板轉化為DNA，將編碼後的序列寫入基因組。這一過程不僅能改變任意核苷酸，還能增刪長達數十個鹼基長度的基因序列。

由此帶來的廣泛應用，為更複雜、更強大的基因編輯工作打開了大門。Nogué指出，單鹼基編輯能避開的植物病原體侵害也就這樣了，「改造越簡單，病毒就越容易逃過去」。Nogué的團隊與INRAE阿維尼翁研究中心的科學家合作，針對嚴重破壞植株的馬鈴薯Y病毒（potyviruses），詳細檢查了自然產生的抗病毒要素，並在eIF4E1基因中發現了一套共5種氨基酸變體，這5種變體能共同保護豌豆植株免於馬鈴薯Y病毒感染[4]。目前，Nogué正在使用先導編輯，將這一保護轉移給馬鈴薯：「我們認為，通過改變多個氨基酸，可以讓植株具備持久的抗病性。」

最初的先導編輯器效率是比較低的，通常和同源定向修復相差無幾。但是有些基因組序列似乎比其它更可控，而且設計精密的先導編輯實驗，效率可以翻倍[9]。「我覺得先導編輯還有改進空間。」高彩霞說。她的團隊已提出多種策略改進先導編輯的效果，如設計複雜的pegRNA，以及採用基於Cas9的編輯複合物的、強化功能的變體。

Nogué團隊則在有明確特徵的模型植物物種中成功運用了先導編輯。他表示，團隊做的某些改良工作，「使得先導編輯像鹼基編輯一樣高效。如果我們在模型植株中觀察到的結果在作物上也成立，那麼我認為，先導編輯會非常非常有效。」

對於研究充分的作物，採用鹼基編輯和先導編輯都比較簡單。朱健康團隊已經就兩種技術在水稻的應用開展了廣泛的研究。不僅如此，研究還證實，小麥、玉米、西紅柿、馬鈴薯等主要作物均可實現可控的編輯。戚益平指出，多種網絡工具，包括高彩霞團隊開發的PlantPegDesigner等，都能夠幫助研究者選擇合適的編輯系統[10]。

但這一過程的若干重要環節仍然相當困難。首先是轉化（transformation），即將編輯機制引入植物細胞的過程。最常用的轉化策略之一，是採用土壤微生物農桿菌（Agrobacterium tumefaciens） 感染植株，隨後將編碼了Cas9蛋白質和相關RNA的DNA質粒引入植物細胞。但是，這樣引入的DNA還會進入植物的基因組，這是人們不想要的結果，因為這個領域的科學家都在儘量避免永久引入外來DNA。不僅如此，基因組編輯機制的長期表達也有風險，可能會出現不想要的修改。

為在轉化過程中杜絕外來DNA，研究者可以把編輯所需材料植入原生質體，即用酶法去除了外部細胞壁的人工培養植物細胞。無論用DNA還是RNA試劑編碼這一編輯過程，此類細胞都大大方便了研究者操作臨時性的轉化。戚益平說：「這樣製造的細胞只有細胞膜，就和人類細胞一樣。」他指出這也是迅速測試和優化鹼基或先導編輯實驗的有效方法。另一種方法是使用「基因槍」，把載有蛋白質和RNA的極小彈子射入胚芽期的植物細胞。採用這兩種方法，基因編輯機制只會在細胞內短暫活躍，隨後即會降解，而不會像把DNA編入原有基因組的做法一樣，讓基因長期表達出來。

不管採用何種轉化方法，研究者隨後都要用編輯後的細胞培育出完整的植株。但對於很多植物物種，生物學家偏偏缺少相應的理論知識和專業技能，把合適的細胞分離出來、培育起來，並實現臨時性的轉化。朱健康說：「自然界有37萬餘種高等植物，但我們能夠成功完成轉化的物種只有數十種。」一些新興技術方案或許會有幫助：例如，過度表達編碼了生長調控因素的基因，可以顯著增加再生基因編輯植物的效率[11]。Puchta說：「這樣一來，很多本來很難轉化的物種，就有了轉化和編輯的可能。」

此外，作物有許多關乎其生長情況、抗病蟲害能力和產出質量的關鍵性狀，人們對其本質生物機制還缺乏基本了解，這也阻礙了相關研究。Nogué說：「不了解基因組，不深刻掌握某一具體性狀背後的機制，此類工具就毫無用處。」

不過，基因組分析技術成本越來越低，效率日益提升，會有助於解決該問題；而且，科學家正在嘗試將一些常規使用的臨床遺傳學技術用到農業領域。例如，位於北卡萊羅納州達勒姆的生物技術公司Pairwise（由劉如謙共同創立並許可使用他的基因編輯技術），正與美國和加拿大的政府部門和學術界合作，識別至少300種獨立漿果物種和品種的50餘種性狀的遺傳基礎，首席技術官Ryan Rapp說。「我們幾乎是從零開始，但現在已合作完成了600餘條基因測序。」

不過，就算只靠現有的工具，基因編輯也在日新月異地取得進展。Rapp透露，Pairwise的首款基因編輯產品——一種強化風味的綠葉蔬菜，預計2023年進入美國市場。它使用的是標準CRISPR技術，還有其他一些鹼基編輯作物正在研發中，包括一款無核櫻桃，不過櫻桃還在測試中，進入市場的時間會晚一些，因為櫻桃樹的栽培周期比田裡栽種的作物長。

上述產品——當然，還有高彩霞團隊的強化甜度草莓——都正是建立公眾和監管機構的信任所需的東西。美國農業部、中國農業部等一些監管機構，在作物沒有採用外來基因的前提下，對於經過CRISPR編輯的作物，管理尺度比轉基因生物寬鬆。另一些監管機構的規定則更嚴格。但是，只有令公眾信服，基因編輯技術才能有立足之地。戚益平說：「我認為，業界已經達成了共識：要讓人們接受基因編輯作物或食品，最好讓它們吸引人一些。」

基因編輯技術的成功，可以開啟一些真正具有變革意義的應用方式，例如讓全球農業未雨綢繆，對抗全球變化的影響。Putcha表示，通過移植單個基因培育耐旱、耐鹽作物，進展還很有限。但他認為，另一個方向可能前景大好：通過修改基因，增強野生植物的可食性和農藝性狀，馴化粗獷的野生作物。

高彩霞的研究已經表明這個思路行得通。2018年，高彩霞團隊及合作方利用了傳統的CRISPR–Cas9編輯技術，通過改寫控制果實大小、產量和營養物質的5個基因，馴化了一種野生的南美西紅柿[12]。「這一馴化過程自然完成需要足足8000年，而我們僅用了一年半。」她說。