鑽石舞台

最近，CRISPR-Cas系統開始被應用在核酸檢測中，由於它具有同時切割靶向核酸和非靶向核酸(用作報告分子)並輸出信號的特性，在新型生物傳感器構建中表現出了巨大的潛力。同時，電化學分析方法具有的高靈敏度、快速響應和成本效益優勢使電化學生物傳感器成為醫學診斷中強大的分析工具。因此，本研究開發了一種基於CRISPR-Cas系統的新型電化學生物傳感器，稱為MoECS(Methodology of Electrochemical CRISPR Sensing)，用於檢測SARS-CoV-2變異株。

CRISPR-Cas12a-Empowered Electrochemical Biosensor for Rapid and Ultrasensitive Detection of SARS-CoV-2 Delta Variant

Chenshuo Wu, Zhi Chen,* Chaozhou Li, Yabin Hao, Yuxuan Tang, Yuxuan Yuan, Luxiao Chai, Taojian Fan, Jiangtian Yu, Xiaopeng Ma, Omar A. Al-Hartomy, S. Wageh, Abdullah G. Al-Sehemi, Zhiguang Luo, Yaqing He, Jingfeng Li,* Zhongjian Xie,* Han Zhang*

Nano-Micro Letters (2022)14: 159

https://doi.org/10.1007/s40820‑022‑00888‑4

1. 以與 SARS-CoV-2 Delta S基因序列相同的 DNA 模板為模型，傳感器可以在無擴增實驗的情況下實現50 fM的檢測限和100 fM至10 nM的檢測區間，同時也具有高特異性和穩定性。

2. 設計的特異性crRNA可以匹配SARS-CoV-2 德爾塔變異株核酸序列上的突變位點，為診斷其它新出現的SARS-CoV-2變體提供了借鑑。

3.基於無線微型電化學平台，所構建的傳感器在即時檢測(POCT)中顯示出良好的應用前景。

首先將MB-ssDNA報告基因固定於修飾電極表面。基於靶標的前間區序列鄰近基序（PAM）以及靶標DNA與crRNA的互補性，設計了導向Cas12a/crRNA雙鏈體，以特異性識別SARS-COV-2的靶標DNA。在沒有目標DNA的情況下，Cas12a-crRNA的切割活性未被激活，MB-ssDNA報告分子保留在修飾電極表面，從而產生了明顯的MB電化學信號。在靶標DNA存在的情況下，Cas 蛋白識別 PAM 序列，Cas12a的反式切割活性被激活，因此MB-ssDNA報告基因被從電極表面非特異性切割，導致MB的電化學信號降低。得益於金納米顆粒的大比表面積，可以將目標識別事件轉化為電極上ssDNA報告基因的大量切割，用於設計高靈敏度的電化學核酸生物傳感器。

圖1. 金納米顆粒輔助CRISPR電化學生物傳感器的原理示意圖。

圖3. (A)電化學阻抗譜 (EIS)表徵；(B)方波伏安 (SWV) 曲線；(C)不同濃度靶DNA的 SWV曲線；(D)電流變化 (ΔI%) 與目標 DNA 濃度的對數之間的線性關係。

IV CRISPR電化學生物傳感器的特異性探究

如圖4所示，當靶標DNA被來自原始SARS-CoV-2病毒的核酸取代時，觀察到明顯降低的ΔI%(16.1%)，這證實了crRNA靶向Delta變體的特異性。此外，MERS、H₁N₁、H₃N₂、B型流感和HRSV均表現出不明顯的信號變化(△I%<10%)，而僅來自Delta變體的靶標DNA表現出顯著的電化學響應(ΔI%=77.9%)。該實驗結果表明建立的電化學生物傳感器能夠以高特異性檢測SARS-COV-2 Delta變體。

V CRISPR電化學生物傳感器的即時檢測應用探究

微型電化學工作站由智能手機連接直接控制，實驗數據可通過藍牙及時傳輸。迄今為止，絲網印刷技術對於SPE的製備已經成熟，因此SPE成本非常低。POCT檢測中靶標DNA的濃度選擇為10 nM，以證明POCT微電化學工作站檢測SARS-COV-2變異株的可行性。如圖5所示，從SWV曲線得到的 MB 的氧化還原峰電流分別為933.05 nA(不含靶標DNA)和280.11 nA(含靶標DNA)，ΔI% 計算為 69.97%，與從傳統電化學工作站獲得的相應ΔI%相比僅10%的差異。顯然，MoECS結合微型電化學平台可用於POCT進行快速SARS-CoV-2 Delta變體的診斷，無需繁瑣的樣品處理。