iNature - Cell | 破解多年難題！陳珏院士團隊發現溶血素 A 分泌系統是包含三個ABC轉運蛋白的多引擎泵－鑽石舞台

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1 型分泌系統 (T1SS) 廣泛存在於致病性革蘭氏陰性細菌中，在整個多肽合成後蛋白質底物被分泌。長期以來，大腸桿菌溶血素 A 分泌系統一直被認為是 T1SS 結構和機制研究的原型。分泌需要三種膜蛋白——內膜 ABC 轉運蛋白 HlyB、銜接蛋白 HlyD 和外膜孔蛋白 TolC。然而，複合物的化學計量和結構是未知的。

2022年9月1日，洛克菲勒大學陳珏院士（2019年當選為美國國家科學院院士）團隊在Cell在線發表題為「The hemolysin A secretion system is a multi-engine pump containing three ABC transporters」的研究論文，該研究在兩種構象中確定的冷凍電子顯微鏡 (cryo-EM) 結構表明，內膜複合物是一個異十二聚體組件，包含三個 HlyB 同源二聚體和六個 HlyD 亞基。

功能研究表明，HlyB 和 HlyD 的寡聚化對於蛋白質分泌至關重要，並且多肽通過 HlyB 中的規範 ABC 轉運蛋白途徑易位。總之，該研究數據表明，T1SSs 需要三種 ABC 轉運蛋白，一種作為蛋白質通道發揮作用，另一種以變構方式為易位過程提供動力。

1 型分泌系統 (T1SS) 是革蘭氏陰性菌中簡單但高效的蛋白質易位系統，能夠分泌 20 至 1,500 kDa 的底物。此外，分泌信號編碼在底物的 C 端序列中，這意味着在多肽完全合成後發生分泌。因此，T1SS 的機制必須與充分表徵的 Sec translocon 的機制不同。

大腸桿菌溶血素 A (HlyA) 運輸系統長期以來一直被用作研究 T1SS 的模型。底物 HlyA 是一種 110 kDa 的毒素，以其溶解紅細胞的能力命名。HlyA 以未摺疊狀態從細胞質分泌到細胞外空間，細胞外 Ca2+ 在那裡誘導其摺疊。轉運系統包括兩種特定的內膜蛋白 HlyB 和 HlyD，以及普遍存在的外膜蛋白 TolC。

HlyB 屬於 ATP 結合盒 (ABC) 轉運蛋白超家族；由 ATP 水解驅動的分子泵。HlyB 中消除 ATP 水解的突變也阻止了 HlyA 的分泌，證明了蛋白質輸出的 ATP 依賴性。與所有 ABC 轉運蛋白一樣，HlyB 包含兩個跨膜結構域 (TMD) 和兩個核苷酸結合結構域 (NBD)。此外，HlyB 和大多數其他內膜 T1SS 含有一個 N 端 C39 樣結構域 (CLD)——該區域與 C39 半胱氨酸蛋白酶同源，但沒有催化半胱氨酸殘基，因此沒有酶活性。

HlyD 是革蘭氏陰性菌特有的一種周質銜接蛋白。它包含一個小的 N 端胞質結構域、一個單跨膜 (TM) 螺旋和一個與 TolC 相互作用的大周質結構域。與 HlyD 同源的蛋白質也存在於tripartite藥物流出系統中，它們在其中形成內膜轉運蛋白和外膜孔蛋白之間的關鍵鏈接。

文章模式圖（圖源自Cell ）

雖然 HlyB 和 HlyD 專用於 HlyA 的分泌，但 TolC 是一種多功能孔蛋白，涉及許多運輸系統，包括tripartite藥物外排系統。體內交聯實驗表明，底物誘導 HlyA 分泌裝置的動態組裝。HlyB 和 HlyD 的組成複合物仍然錨定在內膜中。在底物結合後，可能與 HlyD 的細胞質區域和 HlyB 的 CLD 結合，TolC 被接合，並在細胞質和細胞外空間之間形成一個短暫的「蛋白質隧道」。

雖然結構信息可用於 TolC以及 HlyB 和 HlyD 的可溶結構域，但複合物的化學計量和結構，以及因此多肽轉運的途徑和機制，仍然未知。在這項研究中，該研究使用單粒子冷凍電子顯微鏡 (cryo-EM) 分別以 2.9 和 3.4 Å 的分辨率確定了在不存在和存在 ATP 的情況下組成型內膜 HlyB/D 複合物的結構。這些結構揭示了三個 HlyB 同型二聚體和六個 HlyD 單體的異十二聚體組裝，其結構不同於任何其他 ABC 轉運蛋白系統。

功能測定進一步表明寡聚化對於 HlyA 分泌至關重要，並且多肽通過單個 HlyB 二聚體的規範底物易位途徑而不是複合物的中心孔進行易位。與tripartite多藥外排系統相比，HlyB/D 複合物的獨特結構表明，不同的機制被用於在細菌包膜中分泌小分子與大蛋白質底物。總之，該研究數據表明，T1SSs 需要三種 ABC 轉運蛋白，一種作為蛋白質通道發揮作用，另一種以變構方式為易位過程提供動力。

參考消息：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00920-5#%20

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