嚴重急性呼吸系統綜合徵冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的暴發和傳播對全球公共衛生構成重大威脅。根據世界衛生組織的數據，截至2022年4月29日，全球已確診510270667例COVID-19病例，包括6233526例死亡。該疾病除了對全球經濟產生重大負面影響外，還嚴重影響人類健康。新型冠狀病毒突變率高，β、γ、δ、Omicron等突變株迅速出現，極大地阻礙了疾病的預防，並為其傳播提供了便利。因此，除了有效的治療策略外，開發準確、可獲取和快速的護理點檢測(POCT)和診斷工具至關重要。目前SARS-CoV-2的標準檢測方法是逆轉錄-定量PCR (RT-qPCR)方法，該方法對咽拭子標本中病毒RNA的檢測是一種敏感而特異的診斷策略。該方法耗時(需要大約兩個小時)，需要訓練有素的技術人員，需要反覆加熱和冷卻，此外還需要笨重、昂貴的工具，以及用於試劑保存的特殊低溫儀器。因此，該方法在公共場所快速高通量現場篩選病毒或偏遠地區快速檢測方面存在局限性。
華中科技大學生命科學與技術學院微納生物傳感及醫學人工智能課題組劉鋼教授在《Chemical Engineering Journal》期刊上發表了題為「An ultra-sensitive and specific nanoplasmonic-enhanced isothermal amplification platform for the ultrafast point-of-care testing of SARS-CoV-2」的文章（DOI: https://doi.org/10.1016/j.cej. 2022.138822）。為提高SARS-CoV-2病毒核酸檢測靈敏度，該課題組開發了一種通過巰基正向引物（F-SH引物）修飾納米等離子體芯片構建不對稱的ERA擴增的NanoPEIA平台。該平台可以實現96個樣品的同步測試的實驗室平台，在此基礎上開發了可實時檢測和可視化終點檢測兩個POCT檢測方案。通過對52份臨床樣本（包括21份經RT-qPCR驗證為SARS-CoV-2陽性和31份陰性樣本）的驗證。與RT-qPCR方法相比，NanoPEIA平台對於N和orf1ab基因的檢測靈敏度均為100%略高於RT-qPCR方法（N基因（88.9%）和orf1ab基因（90.0%）；而特異性分別為92.3%（N基因）和91.7%(orf1ab基因)則略低於RT-qPCR方法（均為100%）。NanoPEIA平台對上述臨床樣本測試的LoD分別為28.3copies/mL(N基因)和23.3copies/mL(orf1ab基因)。該平台對於Ct<25的臨床樣本，從樣本採樣、病毒裂解、擴增檢測和數據分析全過程不到6min即可完成。NanoPEIA檢測平台與常規RT-qPCR及其它核酸測試平台相比，NanoPEIA平台的主要優勢體現在以下幾個方面：一、優越的檢測靈敏度和特異性；二、該平台提供了快速一體化病毒核酸檢測平台（提出了簡單快速的病毒核酸裂解方法、將核酸擴增需要的試劑（除模板外）均凍存在擴增裝置里，簡化加樣操作，便於普通人群使用）；三、該平台在高通量的實驗室檢測平台基礎上，開發了針對不同人群需要的實時和可視化的POCT平台。對於不同拷貝數的樣本，整個過程（樣本採樣、病毒裂解、擴增檢測和數據分析）均可在30min內完成。這為當前SARS-CoV-2病毒核酸大批量篩查和家用型核酸檢測提供了新的思路。
方案1 SARS-CoV-2高通量和即時檢測納米等離子體增強等溫擴增示意圖。
圖1納米等離子體陣列芯片(NanoACS)的特性及NanoPEIA評檢測SARS-CoV-2核酸。(a) NanoACS上功能化F-SH引物後進行不對稱ERA擴增反應過程;(b)未修飾F-SH引物的NanoACS俯視圖掃描電子顯微鏡(SEM)俯視圖；(c) 修飾和未修飾F-SH引物的NanoACS俯視圖掃描電子顯微鏡(SEM)俯視圖；(d)未修飾F-SH引物的NanoACS的SEM截面圖；(e)不同引物處理優化不同檢測平台對低濃度質粒DNA模板擴增曲線，包括（1）F-SH引物修飾NanoACS, (2)沒有引物修飾NanoACS(直接將420nm的正向引物加入整個反應體系中)，（3）R-SH引物修飾NanoACS,（4）F-SH引物修飾非納米孔的金膜，（5）F-SH和R-SH引物修飾NanoACS,（6）普通96孔擴增平台，（7）沒有引物修飾NanoACS(直接將132nm的正向引物加入整個反應體系中)；orf1ab質粒靶標濃度：3.54×10³ copies/mL和3.54×10² copies/mL；(f)比較NanoPEIA和RT-ERA對SARS-CoV-2 RNA標準品（orf1ab）基因的檢測靈敏度，(1)為NanoPEIA平台，(2)普通RT-ERA普通；(g)不同靶標濃度的SARS-CoV-2 RNA標準品orf1ab基因在20分鐘時刻的相對熒光強度值(RFU(×10⁵))，NanoPEIA平台(紅色)和RT-ERA(黑色)；(h)基於微孔板式NanoPEIA擴增裝置對SARS-CoV-2 N基因RNA標準品稀釋10倍後的檢測靈敏度。
圖2NanoPEIA平台對β-滅活病毒檢測的敏感性，NanoPEIA平台對γ-突變病毒檢測的普遍性，以及NanoPEIA平台對交叉病毒檢測的特異性。NanoPEIA平台對β-滅活病毒進行10倍系列稀釋樣本驗證(a)N基因和(d) orf1ab基因的靈敏度。NanoPEIA平台對γ-突變滅活株（b）N基因和(e)orf1ab基因的實時擴增曲線。NanoPEIA平台測試交叉滅活病毒N基因(c)和(f) orf1ab基因的實時擴增曲線，NTC為無RNA模板（用無污染的無酶水代替模板）為陰性對照，各組均進行3次重複(n=3)。
圖3NanoPEIA平台對臨床樣本驗證及LoD計算。NanoPEIA測試了52份臨床樣本，包括21份SARS-CoV-2陽性和31份陰性樣本。（a）NanoPEIA平台對9份陽性(Ct ≤38),12份疑似陽性(38<Ct≤40)和31份陰性樣本的N基因檢測。（b）NanoPEIA平台對9份陽性(Ct≤38),12份疑似陽性(38<Ct≤40)和31份陰性樣本的orf1ab基因檢測。組間的統計比較採用非參數檢驗中的t檢驗和Fisher最小差異檢驗。p<0.0001 (****)。（c）NanoPEIA平台和RT-qPCR對N和orf1ab基因測試結果的χ2檢驗。NanoPEIA平台和RT-qPCR對（d）N基因和(e)orf1ab基因測試結果的ROC曲線分析。從截取線的噪聲水平和RFUx10⁵的線性標準曲線中獲取檢測SARS-CoV-2 RNA N基因(f)和orf1ab基因(g)的LoD值。誤差棒由實驗結果的標準差的3倍計算。在濃度較高的區域，較大的誤差棒可能是由於每個實驗組的差異造成的。sen:敏感性。sep:特異性。所有樣品重複3次(n=3)。
圖4NanoPEIA對於SARS-CoV-2核酸工作平台。(a)-(f) RFU(x10⁵)與不同稀釋倍數的S1、S2、S3樣品的時間(min)曲線。對於Ct值為31.12 (N基因)和30.41 (orf1ab基因)的S1樣品(RT-qPCR確認Ct值)，在不同稀釋倍數(原溶液，1:10稀釋，1:10稀釋)下，NanoPEIA對N基因(a)和orf1ab基因(d)的敏感性進行測試。NanoPEIA對Ct值為26.28 (N基因)和26.02 (orf1ab基因)的S2樣品(RT-qPCR確認Ct值)在不同稀釋倍數(原溶液、1:10稀釋倍數、1:100稀釋倍數和1:1000稀釋倍數)下對N基因(b)和orf1ab基因(e)的敏感性進行測試。對於Ct=24.21(N基因)和23.95 (orf1ab基因)的臨床樣本(RT-qPCR確認Ct值)，在不同稀釋倍數(原溶液，1:10稀釋，1:100稀釋，1:100稀釋，1:100稀釋，1:100稀釋，1:100稀釋)下，NanoPEIA對N基因(c)和orf1ab基因(f)的敏感性進行測試。RFUx10⁵在無核酸酶水中對N (g)和orf1ab基因(h)稀釋的P4-P13(3倍濃度)的響應值和Ct值。(i)NanoPEIA(本工作針對Ct值<25的臨床樣品(不計算樣品製備和熱解時間)與SARS-CoV-2其它核酸檢測方法的比較：美國CDC[37]和中國NMPA的RT-qPCR [36], RT-qPCR [33],[34],[35],[31], CRISPR [42], [41], [38], [18], [40], [39], RPA [43], [12], [44], RT-LAMP [48], [45], [47], [53], [46], Biosensor [51], [50], [49]和SHERLOCK [41], [52], [25]。
圖5POCT診斷和可視化檢測。(a)採用簡易核酸提取裝置(95℃，5min)裂解病毒RNA。(b)-(d)三種NanoPEIA擴增裝置示意圖。(b)微孔板式NanoPEIA擴增裝置。(c)管帽式NanoPEIA擴增裝置。(d)管底式NanoPEIA擴增裝置。(e)三種NanoPEIA：微孔板式NanoPEIA擴增裝置，管帽式NanoPEIA擴增裝置，管底式NanoPEIA擴增裝置加樣方式。（f）RNA標準品（orf1ab基因）的RT-ERA(沒有NanoACS裝置)可視化檢測。（g）RNA標準品（orf1ab基因）的基於管蓋式NanoPEIA可視化檢測。從β-滅活病毒提取的RNA的orf1ab基因（h）,γ-滅活病毒RNA的N基因（i）和orf1ab基因（j）基於管蓋式NanoPEIA可視化檢測。(k)採用管蓋式NanoPEIA和(i)基於管底式NanoPEIA對SARS-CoV-2的β-滅活病毒的orf1ab的可視化檢測。(m)通過多功能酶標儀對高通量微孔板式擴增裝置進行實時檢測，驗證POCT檢測的可行性。(n)便攜式實時檢測儀採用管底式NanoPEIA對SARS-CoV-2的β-滅活病毒or1ab進行POCT實時檢測。原文鏈接
https://authors.elsevier.com/sd/article/S1385-8947(22)04302-9
劉鋼：華中科技大學特聘教授,美國醫學生物工程院院士（AIMBE Fellow）,曾任美國伊利諾伊大學香檳分校終身教授。劉教授科研團隊一直致力於超靈敏度微納米新型生物傳感器芯片以及移動傳感技術在醫學、生物學等方面的廣泛應用。近年來，研究僅需通用設備即可完成新冠抗原抗體及核酸一步式快速檢測生物傳感器芯片平台的搭建方案，有望在提升效率的同時大大降低醫院和藥物研發機構的檢測成本。
劉菊香：華中科技大學博士，華中科技大學生命科學與技術學院微納生物傳感及醫學人工智能課題團隊主要研究人員，科研方向為人工智能在納米傳感器中的應用，目前發表SCI十餘篇（TOP頂刊2篇）。相關進展
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