鑽石舞台

在自然界中糖類物質無處不在，幾乎參與了多細胞生物的全部生命過程。但由於糖類化合物結構固有的複雜性，想要獲得結構明確均一的聚糖類化合物，合成難度大，往往需要具有高度專業技能的人員通過手工合成來完成，耗時費力，這嚴重製約着糖科學的發展；而對於分子尺寸更大、結構更為複雜的多糖類化合物的合成，更是一項極具挑戰性的工作。聚糖的高效獲取問題已成為制約糖科學發展的重要瓶頸。

多肽和DNA合成儀的研製成功，帶來了多肽/蛋白質和寡核苷酸/核酸獲取途徑的革命，極大地推動了相關學科的發展。糖科學家也希望聚糖的合成能夠像多肽和寡核苷酸那樣在自動合成儀上實現。近些年來，雖然聚糖固相自動合成和酶法自動合成取得了一定的進展，但聚糖固相自動合成往往需要過量的糖模塊和試劑，通常是通過單糖逐個累加的方式使糖鏈延伸（加法式合成），造成效率低下，而且合成規模較小、無法直接監測反應。酶法自動合成雖然能夠獲得一些天然的生物活性寡糖，但酶的來源有限、底物適應範圍窄，無法滿足各種類型的寡糖合成需要；而且酶法往往需要核苷活化的糖，價格比較昂貴；其糖鏈的延伸也是通過單糖逐個累加的方式而實現（即加法式合成）。因此，糖自動合成技術的發展還處於初級階段。

近日，北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室葉新山教授團隊報道了他們在液相聚糖自動合成領域的突破性研究成果。他們基於「預活化」一釜多組分寡糖合成原理，自主研發了全球首台新型雙模式液相糖自動合成儀，並利用該合成儀自動合成了各種具有重要生物活性的複雜寡糖和多糖；發展了「自動乘法合成」策略，將合成的多糖尺寸提高到驚人的1080-mer，從而將聚糖合成水平提升到了一個新的高度，遠超核酸（到200-mer）和蛋白質（到472-mer）的合成水平。

葉新山團隊長期致力於新的糖化學合成的方法和策略的發展。2004年，他與黃雪飛教授首次明確提出「糖基供體預活化」的新概念，提出了糖基化反應的一種新方式，在此基礎上發展了基於「糖基供體預活化」的一釜寡糖合成新策略（Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 5221）。該策略的優點是只使用帶有常見保護基的糖模塊，不需要對反應中間產物進行分離，省去了中間體分離純化的步驟，從而使合成效率提高。目前該策略已經被應用於各種複雜聚糖的合成，特別是該團隊在2017年運用這個策略首次合成了均一結構的由92個單糖單元所組成的阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan），開創了多糖合成領域的先河（Nat. Commun., 2017, 8, 14851）。該團隊還發展了光介導的「預活化」一釜糖基化反應，展示了其綠色、高效和可控性強的特點（Org. Chem. Front., 2016, 3, 737）。基於以上研究基礎，該團隊着手進行糖合成儀的研製工作。

合成儀的研製包括硬件和軟件兩個方面。硬件主要包括三部分：自動合成系統（包含自動進樣系統和合成輔助系統）、在線監測系統和可編程邏輯控制系統。他們首先設計研發了新型可溫控反應器，既能夠滿足光驅動的反應，也能滿足普通的各種反應類型，適用溫度範圍在-80 ℃-100 ℃之間；緊接着設計研發密閉、雙重控制的準確自動進樣系統，進樣系統在惰性氣體保護下，密閉且無交叉污染的風險，配合相應的控制方案可適用於各種自動化合成；隨後設計研發接近實時的在線監測系統，可以滿足連續多次無交叉自動取樣、進樣、分析、對比判斷，充分利用液相色譜的分析能力滿足自動合成的直接監測需要；最後通過可編程邏輯控制系統耦合自動合成系統和在線監測系統，成功設計了新型雙模式液相糖自動合成儀的整機框架，實現了第一代原型機的順利組裝（圖1）。軟件方面，可編程邏輯控制系統受上位機控制，基於Labview語言程序設計研發了實用的特色上位機軟件控制系統（Ye Glycosoft），完成對合成儀的整機控制和調試，實現了合成儀的穩定運行。

在合成儀原型機成功研發的基礎上，該團隊首先用一個四糖的合成來驗證儀器的可靠性，分別通過普通活化模式和光介導活化模式對四糖進行自動化合成，驗證了合成儀的可行性。為了進一步驗證糖合成儀的功能，該團隊利用所研製的合成儀，進行了如下三個方面的工作：

（1）用合成儀合成了一個含有多種重要生物活性寡糖的化合物庫。他們首先在普通活化模式下（一般以Ph2SO/Tf2O或者p-TolSCl/AgOTf作為活化體系），通過一釜五組分反應（1*5 = 5）完成了兩種β-1,6連接的葡聚五糖的自動化合成；隨後在此基礎上通過一釜三組分反應（5*3 = 15）完成了β-1,6連接的葡聚十五糖的自動化合成。此外，通過一釜五組分反應（1*5 = 5）完成了甘露五糖的自動合成；通過一釜四組分（1*4 = 4）和一釜五組分反應（1*5 = 5）分別完成了β-1,4-連接的殼聚四糖和殼聚五糖的自動合成；通過[1+2+1+2]策略一釜自動合成了結構複雜、具有重要活性的腫瘤相關糖抗原Globo H；含有高碳糖唾液酸的腫瘤相關糖抗原Fucosyl GM1（Fuc-GM1）和cis-糖苷鍵的A血型糖抗原也都被成功構建（圖2）。接下來，在光介導模式下，以Umemoto試劑作為光活化劑，作為N-聚糖和多種腫瘤相關糖抗原核心骨架的polyLacNAc八糖通過四組分反應（2*4 = 8）被成功構建；緊接着作者通過一釜三組分策略完成了以LNT（Lacto-N-tetraose）和LNnT（Lacto-N-neotetraose）為核心結構的七種重要生物活性抗原（H型抗原、B/O血型抗原和LewisX、LewisY抗原）的自動化合成（圖3），這些抗原是人乳寡糖和鞘糖脂的重要組成部分。

（2）以克級規模高效自動製備保護的磺達肝葵鈉五糖。磺達肝葵鈉是首個也是目前唯一一個人工合成的已上市肝素類寡糖抗凝藥物，於2002年上市。雖然目前已有化學合成和化學酶法合成的報道，然而超過50步、總收率低於0.1%的化學合成使其成為最貴的肝素類藥物，限制了其應用。該團隊以p-TolSCl/AgOTf作為活化體系，通過[1+2+2]策略高收率地自動合成了保護的磺達肝葵鈉五糖（圖4）。這是磺達肝葵鈉五糖的首次自動化製備，其合成規模易於放大的特點對於磺達肝葵鈉製備工藝的改進具有重要意義。

（3）多組分自動乘法合成阿拉伯聚糖。在前面工作基礎上，作者開始研究一釜更多組分數的自動合成和大分子尺寸多糖的自動組裝。他們選擇了植物和致病菌細胞壁都普遍存在的阿拉伯聚糖作為合成目標。以p-TolSCl/AgOTf作為活化體系，能夠以一釜十組分反應（1*10 = 10）實現阿拉伯十糖的自動化合成，分離收率為47%（平均每步92%），完成了手工合成難以完成的工作。

在高收率克級規模自動製備阿拉伯六糖的基礎上，作者繼續通過自動乘法合成策略來製備大分子尺寸的阿拉伯聚糖。反應過程包括重複的兩次操作：（1）自動一釜多組分反應獲得供體中間體；（2）脫除供體中間體上的臨時保護基得到受體中間體。從單糖模塊出發，自動一釜六組分反應得到六糖供體（1*6 = 6），脫除六糖供體上的臨時保護基（TBS）得到六糖受體；自動一釜五組分反應得到三十糖供體（1*6*5 = 30），脫除三十糖供體的臨時保護基得到三十糖受體；自動一釜四組分反應得到一百二十糖供體（1*6*5*4 = 120），脫除一百二十糖供體的臨時保護基得到一百二十糖受體；自動一釜三組分反應得到三百六十糖供體（1*6*5*4*3 = 360），脫除三百六十糖供體的臨時保護基得到一個三百六十糖受體；自動一釜三組分反應[360+360+360]，得到驚人的1080糖（分子量達到352,700 Da）。該大分子尺寸的阿拉伯聚糖通過五步乘法擴增獲得（1*6*5*4*3*3 = 1080），是目前人工合成的最大、最長的均一結構的多糖分子。最後，作者通過優化條件，將保護的1080糖進行保護基脫除（1個TBS、1080個Bz和1080個Bn，共2161個保護基），得到完全脫保護的1080糖（分子量達到142,800 Da）（圖5）。

總結

該團隊基於糖基供體「預活化」一釜寡糖合成和連續乘法合成原理，研製出一種新型雙模式的液相糖自動合成儀，它克服了現有的通過單糖逐個累加方式延伸糖鏈方法的缺陷。該合成儀的實用性從三個方面得到了驗證：（1）在普通活化模式或者光介導活化模式下，成功合成了包括各種糖型和糖苷鍵、具有重要生物活性的寡糖化合物庫；（2）合成了保護的抗凝糖藥物磺達肝葵鈉五糖，可以實現克級規模的製備；（3）成功執行了「一釜」十組分自動偶聯反應得到阿拉伯十糖；進而利用自動乘法合成策略，合成了結構均一的阿拉伯聚糖（1080糖！）。這使得代表着人工合成均一結構生物大分子複雜度的單體組成數目首次達到了四位數水平，在多糖合成領域具有重要的里程碑式意義。該合成儀將為非專業人員提供一個組裝目標聚糖的平台，填補國內外在液相糖合成儀研製方面的空白，將為糖科學及其在醫藥和材料領域的應用提供新的有效的工具。

來源：小柯化學

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