鑽石舞台

1.Ag/BP-NS具備出色的表面增強拉曼散射性能和可視化單分子檢測能力。這種顯著的增強可歸因於R6G分子共振、光誘導電荷轉移共振和電磁共振的協同共振增強。

中國科學院上海硅酸鹽研究所楊勇研究員等在本研究中開發了一種通過獨特的光還原將銀納米顆粒嵌入多層黑磷納米片(Ag/BP-NS)中的特殊納米結構來實現SM的可視化檢測和成像。如圖1所示，該多層結構除了存在作為EM「熱點」的大量Ag納米顆粒(約50 nm)外，許多超小的Ag納米粒子(3-5 nm)附着在BP的表面和嵌入納米片，從而激活了Ag-P-R6G的光誘導電荷轉移(PICT)通道並帶來巨大的CM增強。該基底可以在50微升10-20 mol/L的R6G溶液中檢測到單個R6G分子的清晰信號，是在已報道的SERS底物中本徵靈敏度最高的一種基底。此外，研究提出了一種偏振-映射方法來實現單個R6G分子的可視化SERS檢測和拉曼成像。作為實際應用，利用提出的SERS方案結合機器學習方法可以識別單個腫瘤外泌體。該研究中二維Ag/BP-NS納米傳感器的製備和研究為SM的檢測和SERS成像提供了可靠的策略，具有良好的生物學應用前景。

圖1. Ag/BP-NS SERS傳感器合成與應用示意圖。

如圖2所示，在這項工作中合成的複合納米片與已報道的Ag/BP-NS複合材料有顯著不同。除了表面上的大銀納米粒子外，BP納米片的表面和插層之間還分布着許多超小的銀納米粒子。大多數銀納米顆粒(50-100 nm)很好地附着在BP納米片上(圖2a)。隨後，將Ag/BP-NS懸浮液稀釋並剝離納米片以暴露納米片內層。如高角度環形暗場(HAADF)圖像(圖2c)所示，可以觀察到大量直徑約3-5 nm均勻分布的超小Ag納米顆粒緊密附着在表面或嵌入BP納米片。然而，在沒有光照的情況下合成的Ag/BP-NS樣品中幾乎沒有觀察到小尺寸的銀納米顆粒(圖2d)。這是由於BP納米片在光激發下可以產生大量的光生電子，使得Ag納米粒子的成核速度迅速提高，從而提高了溶液中Ag納米粒子的還原效率。此時一些成核納米粒子在溶液中Ag⁺耗盡之前將無法生長，因此超小的Ag納米粒子原位沉積在納米片的表面和插層。

IIAg/BP-NS納米片上的單分子檢測

為了驗證Ag/BP-NS的單分子檢測能力，進行了以下驗證。一般來說，如果探針分子的濃度小於10⁻¹¹ M，在不考慮基底對探針分子富集的情況下，顯微拉曼測量區域(激光聚焦區)中可檢測分子數僅有單個分子或幾個分子。如圖4a所示，這裡收集了從10⁻⁸到10⁻²⁰ M的一系列濃度梯度的R6G分子的拉曼信號。需要注意的是，由於R6G分子的極化特性，在低濃度下R6G的指紋峰不會全部出現，只有分子極化方向與偏振光方向相同的振動才會被增強。圖4c-e給出了不同濃度(10⁻¹⁸-10⁻²⁰ M) R6G在Ag/BP-NS基底上的拉曼映射(Mapping)圖像和SERS成像結果。

在如此低的濃度下，可以排除分子聚集的干擾，所以可以認為真正得到了單分子的信號。隨後，計算了Ag/BP-NS基板上R6G在1360 cm⁻¹處的特徵峰強度。如圖5a所示，拉曼信號在10⁻⁷到10⁻¹⁰ M範圍保持很好的內線性關係，相關係數為0.94001。然而，當濃度低於10⁻¹¹ M時，獲得的探測信號不再與之前的數據線性相關。並且數據之間的強度波動變化不大，說明在出現信號的區域處只有一個或幾個R6G分子。然後，這裡提出了一種偏振-映射方法來分析從超低濃度溶液中獲得的R6G信號是否由單分子發射。圖5b給出了偏振-映射策略的示意圖。R6G分子是不對稱的，所以分子具有極性。因此，其拉曼光譜具有偏振特性。如果拉曼光譜不是單分子發射的，而是大量分子吸附在基板上並隨機分布。那麼採集到的分子信號在各個方向的極化張量是具有平均效應的統計結果。因此，當在光路中添加偏振片時，偏振光譜之間只會存在強度差異。相反，對於單分子偏振光譜，與偏振光方向不同的極化方向就不會被增強，所以光譜的差異不僅會表現在強度上，還會導致一些峰的消失和相對強度的變化。因此，可以通過研究R6G分子的偏振拉曼光譜來判斷信號是否是單分子發出的。

在這裡，分別在激光器後方和信號收集器之前各放置一個偏振片，隨後通過mapping在10⁻¹⁵ M R6G樣本中掃描60×60 μm²的矩形區域並分析其中的清晰信號。通過轉動信號收集器前面的偏光片，使其與激光器後面的偏光片平行或垂直， R6G的平行和垂直偏振光譜均在同一點採集。如圖5c所示，將信號採集器前的偏振片旋轉90°後，部分指紋峰明顯消失，平行偏振光譜與垂直偏振光譜的特徵峰的相對強度也發生了變化。這是由於偏光片濾掉了單分子在其他方向上的散射光子，該實驗給出了單分子存在的重要證據。基於上述原理和實驗結果，我們提出了一種結合映射和偏振光譜來表徵單分子的方法。如圖5d-f所示，在這裡，我們採用1648 cm⁻¹的拉曼強度進行映射成像。當沒有在光路中添加偏振片時，獲得了16個清晰的分子信號(圖5d)。在光路中加入偏振器後，指紋峰的變化反映在垂直偏振映射光譜中，部分信號消失(圖5e)。繼續旋轉偏振片，如圖5f所示，原本在垂直映射中出現的一些清晰信號也消失了。但無論是平行偏振光譜還是垂直偏振光譜，信號的位置都可以與未放置偏振片的光譜一一對應。上述現象表明，可以實現基於Ag/BP-NS的單分子可視化檢測和表徵。

如圖6a所示，分別通過(1)光還原法和(2)普通方法合成了Ag/BP-NS的懸濁液，以及通過(3)化學還原法合成了Ag的懸濁液。通過不同方法合成的Ag納米顆粒的尺寸相似(圖6b-e)。然而，通過光還原合成的雜化納米片的懸濁液外觀更接近銀膠體，既產生了更多的銀納米顆粒，這也由SEM圖像所證實(圖6b、d)。正如上面提到的，BP納米片在激發光下可以產生大量的光生電子，以提高Ag納米粒子的還原效率。因此，光還原方式帶來了像化學還原一樣更高的還原效率，必然會帶來更多的「熱點」。

如圖7a-c所示，通過有限差分時域(FDTD)模擬了BP納米片和Ag/BP-NS納米片的電磁場分布情況。BP的局部等離子體共振可以被532 nm入射光激發(圖7a)。隨後，計算了吸附在BP上的二聚體(Ag納米顆粒)。如圖7b所示，直徑為50 nm 的Ag顆粒提供了明顯的電磁增強。強耦合共振主要分布在二聚體(Ag納米粒子)的「間隙」和BP表面。根據SERS增強因子與局域電場增強因子的對應關係，電磁可以提供大約10⁸的增強。

雖然直徑為5 nm的Ag納米粒子沒有提供明顯的電磁增強(圖7c)，但BP/Ag異質結構中高效的載流子遷移率可以有效地促進化學增強過程和光活性。如圖8a所示，通過Gaussian計算的R6G光譜表明Ag4-P6簇中存在明顯的化學增強。更重要的是，Ag4-P6-R6G簇的計算帶隙(圖8b)更接近532 nm激光下的「帶隙共振」(2.33 eV)。

除了EM和CM的計算結果，下面又通過實驗進一步證明了該體系存在顯著的電荷轉移。如圖9a所示，Ag納米顆粒(約50 nm)由於等離子體共振和R6G在532 nm處的光吸收之間的耦合，可以強烈增強分子的拉曼信號。Ag納米粒子的光吸收在532 nm後逐漸下降(圖8c)。所以推測，在633和785 nm波長下增強效果會逐漸減弱。如圖9b所示，實驗結果確實與預測結果一致。雖然Ag/BP-NS 的光吸收在785 nm處迅速下降，但在633 nm處並未下降。然而，在改變激發波長後，基底的增強作用迅速消失(圖9c、d)，這不符合EM定律。因此，在Ag/BP-NS中必然存在「帶隙共振」的化學增強。與未光照製備的納米片相比，光還原(hv)製備的Ag/BP-NS在633 nm激發光下仍保持一定的增強，這也證實了光還原可以給納米片帶來更多的「熱點」。此外，光還原基底的光吸收強度也顯着高於其他基底。總之，通過光還原製備的Ag/BP-NS具有三各方面的協同共振，包括Ag納米粒子周圍的電磁共振(約50 nm)、光誘導電荷轉移共振(Ag-P-R6G簇)和分子共振。

IV基於Ag/BP-NS的腫瘤外泌體檢測

最後利用機器學習的方法進行光譜識別，研究中選擇了兩種外泌體和PBS干擾各自100個光譜進行訓練和測試。隨機選擇300個光譜中的60%作為訓練集，其餘光譜作為測試集。如圖10a、b所示，經過訓練的模型在預測訓練集和測試集時的靈敏度值分別為100%和99.17%。事實上，測試集中只出現了1例誤判，這表明Ag/BP-NS結合機器學習方法具有在單囊泡水平上區分腫瘤外泌體的能力。

圖10

結論：研究通過光還原方法合成了一種獨特的Ag/BP-NS納米片。Ag/BP-NS表現出驚人的本徵SERS靈敏度，EF為0.101×10¹²，LOD可以達到單分子水平。檢測過程無需任何物理富集，即可在10⁻²⁰ M R6G 溶液中獲得清晰的單分子信號。Ag/BP-NS基底優異的SERS增強能力來自於電磁共振、光誘導電荷轉移共振和R6G分子共振的協同共振增強。此外，我們通過提出的偏振-映射光譜，實現了單個R6G分子在Ag/BP-NS上的精確定位和SERS成像。該基底在實際應用中也具有優異的性能，具有良好的生物相容性和均勻性。結合SERS成像和機器學習，可以區分和識別不同細胞系中的腫瘤外泌體。所製備的二維Ag/BP-NS具有單分子/囊泡檢測能力，結合其在腫瘤治療領域的優異性能，有望建立獨特的腫瘤檢測和治療體系。