肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）是肝臟切除手術和肝臟移植手術中不可避免的併發症，是術後肝功能障礙和肝功能衰竭的主要原因。精準、快速導航HIRI病灶對早期預警並及時制定預處理計劃和策略阻止HIRI進一步的進展具有重要意義。然而，現有的肝損傷檢測方法仍然無法術中實時精準定位肝臟損傷部位。HIRI與肝臟氧化應激密切相關，氧化應激能夠損傷溶酶體降解功能，最終導致溶酶體粘度的顯著改變。因此，溶酶體粘度有希望作為精準定位HIRI的潛在生物標誌物。基於以上背景，山東師範大學唐波教授、李平教授課題組發展了一個粘度激活型近紅外二區（NIR-Ⅱ）熒光探針（NP-V）用於HIRI過程中肝細胞及小鼠溶酶體粘度的檢測。作者首次揭示了在HIRI過程中活性氧（ROS）—丙二醛（MDA）—組織蛋白酶B的信號通路，進一步使用探針NP-V對小鼠HIRI病灶進行高信噪比的NIR-Ⅱ熒光成像，實現了對肝臟病灶組織輪廓與邊界的清晰辨別，從而精準定位並切除炎症病灶。這一工作證實了NP-V作為雙功能探針在闡明HIRI發病機制和在臨床應用中引導HIRI病變部位的潛力。相關工作以」Precision Navigation of Hepatic Ischemia−Reperfusion Injury Guided by Lysosomal Viscosity-Activatable NIR-Ⅱ Fluorescence」為題發表在國際權威雜誌Journal of the American Chemical Society上，併入選Supplementary Cover。該項研究工作也是唐波教授、李平教授課題組於2013年在Journal of the American Chemical Society（J. Am. Chem. Soc., 2013, 135, 14956-14959）上發表關於肝臟缺血再灌注損傷中超氧陰離子自由基波動的動態和可逆熒光成像的工作之後，在肝臟缺血再灌注損傷研究方面取得的又一個突破性研究結果。該熒光探針NP-V表現出卓越的優點，包括在864 nm處13倍的熒光「off-on」響應、在NIR-Ⅱ窗口存在明顯的熒光開啟（圖1）及良好的生物相容性。此外，NP-V在肝細胞溶酶體內積累，呈現紅色點狀熒光（圖2）。圖 1. 粘度響應型NP-V的結構和熒光性質。（A）粘度發光機理及ICG與IR-783的化學結構。（B）不同粘度的水-甘油體系中NP-V的吸收光譜。（C）NP-V在不同粘度的水-甘油體系中的熒光光譜。（D）logF864與logη之間的線性關係。（E）NP-V在810-1200 nm波長範圍內對不同粘度的NIR-Ⅱ熒光響應。（F）NP-V對不同ROS，RNS和金屬離子的熒光響應。（G）NP-V對體內豐富的酶的熒光響應。
圖 2. NP-V的亞細胞定位及熒光成像肝細胞粘度變化。（A）肝細胞共孵育NP-V（紅色通道）與相應的細胞器靶向染料（綠色通道）的共定位圖像。（B）使用NP-V檢測地塞米松預處理肝細胞（0, 5, 10, 20 min）後的溶酶體粘度動態變化。（C）B圖的相對熒光強度輸出。
NP-V成功實現了HIRI過程中溶酶體粘度變化的實時成像檢測（圖3）。HIRI細胞與對照組相比表現出2.9倍熒光信號增強，說明溶酶體粘度能夠作為HIRI的關鍵指標，用來有效區分正常肝細胞與HIRI細胞。圖 3. HIRI過程中肝細胞溶酶體粘度的實時熒光成像。（A）在10、20、30、40和50 min時，對照組和HIRI組肝細胞溶酶體粘度的熒光圖像。（B）對照組肝細胞的相對熒光強度輸出。（C）HIRI組肝細胞的相對熒光強度輸出。有研究報道ROS與細胞微環境粘度密切相關。通過使用超氧陰離子（O2•−）和過氧亞硝基陰離子（ONOO−）響應型LW-OTf探針，作者發現了HIRI過程中溶酶體ROS含量顯著上升，並且溶酶體過量的ROS能夠調控溶酶體粘度的變化（圖4）。作者進一步證實了HIRI過程中溶酶體ROS積累引起溶酶體MDA含量升高。圖 4. HIRI期間肝細胞溶酶體ONOO−、O2•−和粘度的實時熒光成像。（A）肝細胞溶酶體ONOO−（藍色通道）和O2•−（紅色通道）的同時熒光成像。（B）肝細胞ROS（綠色通道）和溶酶體粘度（紅色通道）的同時熒光成像。（C）A圖的相對熒光強度輸出。（D）B圖的相對熒光強度輸出。（E）對照組和HIRI組肝細胞溶酶體中的相對ROS水平。
接下來，作者重點研究了HIRI過程中過量MDA對下游蛋白的作用靶點。作為最豐富的溶酶體蛋白酶，組織蛋白酶B控制溶酶體中的蛋白質降解並維持微環境穩態。通過使用組織蛋白酶B活性試劑盒，作者發現HIRI組肝細胞內具有比對照組更低活性的組織蛋白酶B。聯合蛋白質質譜技術對組織蛋白酶B進行蛋白質組學分析，如圖5所示，在賴氨酸、組氨酸、精氨酸和天冬酰胺位點檢測到了11種席夫鹼和二氫吡啶MDA加合物。圖 5. 組織蛋白酶B與MDA反應的蛋白質組學分析（部分圖片）。在氨基酸位點H224 (A)、K220 (B)和N246 (C)上的代表性MDA 席夫鹼加合物（+54 Da）。
基於以上實驗，HIRI過程中溶酶體ROS—MDA—組織蛋白酶B級聯信號通路介導粘度變化首次被揭示。最後，通過NIR-Ⅱ活體成像與組織病理學檢查，探針NP-V用於活體小鼠內精準導航HIRI肝臟病變部位及成像指導病灶切除的能力被證實（圖6）。基於溶酶體粘度的策略有潛力在肝臟學研究中進一步應用，以揭示HIRI的發生和發展，並有望用於評價HIRI藥物的體內治療效果。圖 6. 小鼠NIR-Ⅱ熒光成像及NIR-Ⅱ熒光成像引導下的HIRI病變切除。（A-C）精準導航和手術切除HIRI小鼠肝臟病灶部位的代表性NIR-Ⅱ熒光圖像。D 離體器官的NIR-Ⅱ熒光和明場成像圖使用1000 nm長通濾光片。（E）A-C圖的相對熒光強度輸出。（F）HIRI組小鼠肝臟切除部位（藍色圓圈區域內）的H&E染色。（G）HIRI小鼠肺、脾、腎、心臟組織H&E染色。
本研究工作得到國家自然科學基金、山東省重點研發計劃、山東省國家科學基金資助項目、中央政府引導的地方科技發展基金、英國皇家學會、國家留學基金委、巴斯大學的大力資助。衷心感謝山東師範大學唐波教授/李平教授團隊、巴斯大學Tony D. James教授團隊的支持。該論文第一作者是山東師範大學博士研究生劉繼紅。山東師範大學張雯副教授、巴斯大學吳廬陵博士、Tony D. James教授、山東師範大學李平教授和唐波教授為論文共同通訊作者。山東師範大學為第一單位。張雯，分析化學專業博士，山東師範大學副教授，碩士生導師。2015年進入山東師範大學化學化工與材料科學學院。主要從事功能小分子熒光探針的設計合成，並探索其在生物傳感與成像領域的應用研究。以第一或通訊作者身份在J. Am. Chem. Soc.，Angew. Chem. Int. Ed.，Chem. Sci.，Anal. Chem.，Chem. Commun.等國際重要的學術刊物上面發表論文10餘篇。吳廬陵，英國巴斯大學化學系博士，博士期間在國家留學基金委及英國巴斯大學共同資助下，主要從事用於生物體內環境和疾病生物標誌物的新型熒光探針開發，構建了靈敏、高選擇性的活細胞成像方法並用於藥物篩選。特別是基於多種邏輯與雙重響應策略創新發展了針對多種目標物的同時成像分析方法。以第一和通訊作者在J. Am. Chem. Soc.，Nat. Rev. Chem.等期刊發表SCI論文23篇，包括ESI高被引5篇。曾擔任Front. Chem. Sci. Eng. 和Front. Chem.期刊的客座編輯，也是JACS Au, Chem. Sci. 等期刊獨立審稿人，並參編英國皇家化學會出版專著《Fluorescent Chemosensors》。Tony D. James教授，英國巴斯大學化學系教授，英國皇家化學學會會員。1986年於英國東安格利亞大學獲得學士學位，1991年於加拿大維多利亞大學獲得博士學位，1991到1995年期間於日本Shinkai教授課題組做博士後，1995到2000年期間於英國伯明翰大學任皇家學會研究員。2013年因對日本和英國科研合作做出的傑出貢獻獲得了達億瓦-艾德里安獎。長期從事分子識別，分子組裝，熒光探針方面的研究，是糖識別及超分子化學方向的國際知名專家。Tony D. James教授已出版兩本專著，在Nature, Nat. Chem., Chem. Rev., Chem. Soc. Rev., JACS和Angew. Chem. Int. Ed.等國際學術期刊上發表388餘篇學術論文，此外擁有25項國際專利。https://researchportal.bath.ac.uk/en/persons/tony-james李平，山東師範大學二級教授、博士生導師，享受國務院政府特殊津貼、入選百千萬人才工程國家級人選、國家有突出貢獻中青年專家、泰山學者、教育部「長江學者和創新團隊發展計劃」創新團隊帶頭人、教育部「全國高校黃大年式教師團隊」骨幹成員、山東省有突出貢獻的中青年專家、山東省優秀研究生導學團隊負責人、山東省高校重點實驗室首席專家、山東生物醫學工程學會專業委員會委員、山東省科協國家級科技思想庫決策諮詢專家、AIMS Materials Science編委、中國致公黨山東師範大學基層委員會副主委。李平教授多年來致力於新型光學功能探針的構建，以及細胞與活體內生物活性分子化學成像的研究工作，取得了一系列重要突破和研究進展。已主持完成國家重點基礎研究發展計劃（「973計劃」）課題1項、國家自然科學基金面上項目3項、國家重大新藥創製課題子課題1項、國家自然科學基金青年基金1項、山東省自然科學基金重大基礎研究項目1項及山東省科技攻關項目1項。目前主持國家自然科學基金面上項目1項。相關研究成果已在J. Am. Chem. Soc.，Angew. Chem. Int. Ed.，Chem. Sci.，Anal. Chem.，Chem. Commun.等國際重要的學術刊物上面發表論文80餘篇，其中影響因子5.0以上70餘篇，10.0以上10餘篇，論文總引用達3000餘次。作為主要參與者完成的項目，先後榮獲國家自然科學二等獎（3/5）、國家科技進步二等獎（8/10），山東省自然科學一等獎（2/4）、山東省自然科學二等獎（1/4）、山東省科技進步一等獎（5/8）、山東省青年科技獎以及山東高等學校優秀科研成果二等獎（1/3）等。此外，李平教授還曾獲山東省教育系統女職工建功立業標兵、齊魯最美教師——山東省教書育人楷模、山東省省級教學成果獎一等獎（9/10）、山東師大研究生教育教學成果獎一等獎（9/10）、山東師大優秀教學獎及「青年教學能手」等榮譽稱號。http://www.lipinglab.com/唐波，漢族，1964年11月生，中共黨員，1994年畢業於南開大學化學系，獲理學博士，化學化工與材料科學學院教授、博士生導師，南開大學兼職教授，山東大學兼職博士生導師，教育部科技委學部委員，首屆十佳全國優秀科技工作者提名獎獲得者（山東省唯一），973計劃首席科學家，國家傑出青年科學基金獲得者，「新世紀百千萬人才工程」國家級人選，入選「泰山學者攀登計劃」，是國家自然科學基金委員會第12、13屆專家組成員，農藥、醫藥中間體清潔生產教育部工程研究中心主任，「分子與納米探針」教育部重點實驗室主任，山東省「十二五」分析化學特色強化重點學科負責人，山東省「十二五」高等學校強化建設太陽能化學轉化與儲存重點實驗室學術帶頭人，山東省精細化學品清潔合成重點實驗室學術帶頭人；山東師範大學省級化學學科帶頭人、分析化學學科帶頭人，化學博士學位授權一級學科負責人，化學博士後科研流動站負責人，他所領導的團隊是教育部「長江學者和創新團隊發展計劃」創新團隊和山東省優秀創新團隊。現主要從事分子及納米熒光探針的合成及其在生物成像中的應用、綠色化工、熒光材料合成及太陽能化學轉化與儲存等方面研究工作。在理論研究領域，在Nat. Commun., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Nano Lett., ACS Nano, Adv. Funct.Mater., Anal. Chem., Biomaterials, Lab Chip, Chem. Commun.等雜誌發表SCI論文500餘篇，影響因子大於5.0的300餘篇，引用達20000餘次，榮獲國家自然科學二等獎1項，山東省自然科學獎一等獎1項。在應用研究方面，申請國家發明專利44項，已授權31項；榮獲國家科技進步獎二等獎2項，山東省科技進步獎一等獎2項、技術發明獎一等獎1項。在國內建立高新技術產業化基地與合作基地6個，研製與開發產品40餘種，取得了顯著的經濟效益與社會效益。唐波的研究成果引起了國內外的廣泛關注，多次參加國內外學術會議，進行學術交流。主持國家重點基礎研究發展計劃（973）、國家自然科學基金重點項目、國家自然科學基金科學儀器基礎研究專項等多項國家級項目。http://www.tangb.sdnu.edu.cn/index.htm本文為開放獲取文章
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J. Am. Chem. Soc. 2022, ASAP
Publication Date: July 6, 2022
https://doi.org/10.1021/jacs.2c03832
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主編：Erick Carreira（ETH Zürich）
JACS was founded in 1879. It is the flagship journal of the American Chemical Society and the world's preeminent journal in all of chemistry and interfacing areas of science. This periodical is devoted to the publication of fundamental research papers and publishes approximately 19,000 pages of Articles, Communications, and Perspectives a year.
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