鑽石舞台

創新點：美國俄勒岡州立大學化學系方翀教授課題組與生物化學及物理系Ryan Mehl教授課題組通過對基於四嗪標記的綠色熒光蛋白（GFP）的製備及超快光譜研究，發現其獨特的生物正交光敏性來自於熒光共振能量轉移（FRET）的分子實時調製。由此通過蛋白質設計及定點突變，研究者高效實現了迄今為止最高的生物正交光敏性。

關鍵詞：生物正交工具箱，結構-功能關係，飛秒瞬態吸收光譜，基因代碼擴展，蛋白質理性設計，熒光增強，超快能量傳遞

正文：生物正交熒光增強效應是近來活躍及有力的生物成像技術之一，因其所用的探針可以實現低熒光背景，高信噪比，及不干擾內源性生物化學過程。其中的四嗪（1,2,4,5-tetrazine）探針被日益重視，因它不僅可以湮滅熒光，而且是一個有正交活性的官能團。當Tet-v2.0-Me被標記在位點150時，超級摺疊GFP（sfGFP）的熒光量子產率（fluorescence quantum yield；FQY）從0.65驟降為0.07。當和環丙烷融合的sTCO分子作用後，FQY恢復到0.64，對應導通比（turn-on ratio）是9.1。有趣的是，當Tet-v2.0-Me被標記在位點134時，sfGFP的FQY從有四嗪標記時的0.53增加到四嗪-sTCO反應後的0.62，熒光導通比只有1.2。位點150 和134分別與蛋白質發色團（chromophore）相近與相遠，所以FQY的降低主因是光激發能量從發色團（給體，donor）向四嗪（受體，acceptor）的能量轉移。由於這個分子內源過程快於納秒（熒光態典型壽命），方翀研究組運用飛秒瞬態吸收光譜（femtosecond transient absorption）技術對溶液相的一系列熒光蛋白進行了實時觀測（圖1）。

俄勒岡州立大學方翀教授課題組優化實驗條件，獲得了sfGFP，GFP134-Tet和GFP150-Tet 的電子瞬態吸收光譜。蛋白質發色團的激發態壽命從sfGFP的2.2納秒，縮短至GFP134-Tet的1.8納秒，並顯著縮短至GFP150-Tet的0.12及0.92納秒。通過一系列定量的時間常數、量子產率、FRET速率及效率計算，輔以量子化學及分子動力學計算，研究者發現GFP150-Tet的FRET給體（發色團）及受體（四嗪）存在三重構型：較好，中等（隨機），及較差的躍遷偶極矩位列（圖2）。基於此多相性，改變四嗪基團的微觀環境或可提高GFP150-Tet的熒光增強效應：策略一是通過Y200A突變實現結構「疏鬆」從而增加四嗪的靈活性，提高中等構型的布居；策略二是通過S202Y突變實現結構「緻密」從而限制四嗪的靈活性，提高較好構型的布居。新設計完成的GFP150-Tet-Y200A和GFP150-Tet-S202Y體外實驗中，暗態的FQY變成0.042和0.022，而相應亮態的FQY是0.57和0.68，對應的熒光導通比（fluorogenicity）顯著上升至14和31（圖2）。

俄勒岡州立大學Ryan Mehl教授課題組將GFP150-Tet-S202Y（含Tet-v3.0-Bu標記）應用於真核生物細胞（HEK293T）實驗中，證實了fluorogenicity的增加。這些與激發態、FRET、fluorogenicity息息相關的光譜數據和機理研究將為表徵及發展下一代生物正交探針及高分辨、高速率熒光成像提供理論支持及強大助力。

相關結果發表在Natural Sciences (DOI: 10.1002/ntls.20220028)上，文章第一作者為Longteng Tang（唐龍騰），通訊作者為Ryan Mehl和方翀。