ACS美國化學會 - ACS Chem. Biol. │ 基於結構設計的噬菌體Qβ顆粒用於疫苗載體開發－鑽石舞台

英文原題：Structure Guided Design of Bacteriophage Qβ Mutants as Next Generation Carriers for Conjugate Vaccines

通訊作者：金香淑, 密歇根州立大學;黃雪飛,密歇根州立大學

供稿人：梁軒, 北京大學

大家好，本期為大家分享一篇發表在ACS Chemical Biology上的文章，文章題目為「Structure Guided Design of Bacteriophage Qβ Mutants as Next Generation Carriers for Conjugate Vaccines」，文章的通訊作者是密歇根州立大學的金香淑博士和黃雪飛教授。本文中，作者們對噬菌體的Qβ顆粒進行了結構分析和突變改造，提高了其誘導產生目的抗體的能力和專一性，並證明了其在疫苗設計中的普適性和應用潛力。

疫苗能夠有效治療和預防多種疾病，為了增加疫苗的安全性，人們將亞單位抗原與疫苗載體結合構建結合疫苗。結合疫苗中使用最多的抗原是腫瘤相關碳水化合物抗原 (TACA), 但TACA無法單獨誘發有效的抗癌免疫反應，因而需要免疫載體的輔助，免疫載體可以起到遞送抗原和增強疫苗免疫反應的作用。病毒樣顆粒 (VLP) 是一類新型的用於疫苗設計的免疫原性載體, 其中的噬菌體的Qβ顆粒也可用於疫苗載體，但Qβ 還會誘導產生抗Qβ 本身的抗體，可能會干擾機體對目標抗原的免疫響應。因此，作者們想根據Qβ的晶體結構進改造，從而提升其作為疫苗載體的性能和安全性。

首先，作者們測試了Qβ誘導抗TACA的 IgG抗體的能力。他們選擇了在人類癌症中廣泛存在的Tn作為TACA的代表性抗原，先得到NHS-Tn 衍生物，進而合成Qβ-Tn共軛物(wtQβ-Tn)，質譜分析表明wtQβ-Tn 的每個Qβ顆粒平均修飾有370個 Tn。然後作者們分別在第 0、14 和 28 天向小鼠注射wtQβ-Tn或wtQβ，收集血液，利用BSA-Tn 作為包被抗原進行抗 Tn IgG 抗體的 ELISA 分析。結果發現wtQβ-Tn 可以誘發大量的抗 Tn IgG 抗體，證明Qβ確實是能夠有效誘導抗Tn IgG抗體反應的優秀疫苗載體。此外作者也用Qβ作為包被抗原進行了ELISA分析，發現wtQβ-Tn還能夠大量的抗Qβ 抗體，並且隨後實驗表明抗Qβ 抗體的產生無法通過異源 Prime-Boost方案來減少，這不利於疫苗的開發。

圖1. Qβ 是誘導抗 Tn IgG 抗體反應的強大載體

接下來作者嘗試通過Qβ的結構分析和突變設計來降低其抗載體抗體的誘發水平。鑑於抗Qβ抗體的產生源於Qβ上的特異性B 細胞識別表位，作者們製備了覆蓋 Qβ 外殼蛋白的肽庫並用ELISA進行篩選，結果表明：Qβ的B細胞表位並不是連續的線性氨基酸序列，有可能只是在蛋白的三維結構中彼此接近。為了指導Qβ的B細胞表位的分析和突變，作者藉助XRD技術解出了Qβ外殼蛋白的晶體（PDB:7TJM），分辨率4.2 Å。接着他們計算了Qβ 外殼蛋白每個殘基的相對可及表面積（RASA），發現N10，K16，A38，T75和E103的RASA最大，是最靠近表面的殘基。接着作者們利用DiscoTope 2.0（一個基於殘基的表面可及性和空間鄰域預測不連續 B 細胞表位的程序）對Qβ晶體結構進一步分析，得出結論：K16、A38、T75 和 E103最有可能位於Qβ的B細胞表位。作者們將A38、T75 和 E103突變為賴氨酸，從而破壞B細胞表位，同時這些突變後的賴氨酸還可以被Tn抗原偶聯修飾，從而提高B 細胞表位的屏蔽效果。除此之外，作者們發現引入A40C和D102C這兩個突變可以使得Qβ二聚體的單體之間形成額外的二硫鍵，從而提高其熱穩定性。

圖2. Qβ 結構分析和突變改造

基於前述發現，作者構建了一系列Qβ的突變體（A38K、T75K、A40C/D102C和A38K/A40C/D102C），稱為mQβs。使用相同的方案和Tn偶聯，並且保持各個突變體上Tn的修飾量與wtQβ-Tn基本相同，同樣使用ELISA檢測mQβ-Tn誘導抗體產生的能力。結果表明大多數突變均能產生更高水平的抗 Tn IgG 抗體，特別是mQβ(A38K/A40C/D102C)-Tn，它能誘導產生1.8×10 7 個ELISA單位的抗Tn IgG抗體，比wtQβ-Tn高10倍，也是目前已經報道中最高的。除此之外，mQβ-Tn誘導產生的抗載體抗體的量也明顯低於wtQβ-Tn。

圖3. Qβ作為Tn載體的性能評估

隨後作者藉助流式細胞術分析了mQβ(A38K/A40C/D102C)-Tn對表達 Tn 的腫瘤細胞的識別和結合能力。結果表明：由mQβ(A38K/A40C/D102C)-Tn 引發的 IgG 抗體與 TA3Ha 細胞（表達有Tn抗原）的結合能力明顯強於wtQβ-Tn。此外，作者還證明mQβ 載體誘導抗Tn IgG抗體的能力也明顯強於常見的基準蛋白載體（KLH、TT 和 CRM-197）。

接下來作者評估了mQβ作為疫苗載體的普適性。GD2是另一種常見的TACA抗原，它們藉助類似策略合成了mQβ-GD2和wtQβ-GD2，證明mQβ同樣能增強針對 GD2抗原的免疫反應。此外，他們還選擇了SARS-CoV-2 的RBD肽表位，證明mQβ 偶聯物還可以有效誘導產生靶向 SARS-CoV-2 相關肽抗原的抗體。上述分析表明mQβ可用作各類抗原疫苗的載體，具有很好的普適性。