北京大學化學與分子工程學院雷曉光教授課題組、唐淳教授課題組與北京生命科學研究所董夢秋研究員課題組合作，在Nature Communications雜誌發表合作論文，題目為「Characterization of protein unfolding by fast cross-linking mass spectrometry using di-ortho-phthalaldehyde cross-linkers」。該研究報道了一類最新開發的、賴氨酸選擇性化學交聯劑DOPA（di-ortho-phthalaldehyde cross-linkers）；並證明DOPA交聯劑具有不易水解、反應速度快，以及對低溫、低pH和變性劑具有良好兼容性等特點；該化學交聯劑被運用於捕獲蛋白質變性去摺疊的中間態和終態構象，以及追蹤蛋白質構象變化等重要生命過程，從而推動了化學交聯質譜技術的發展，提升了其在蛋白質結構與功能解析中的應用前景。
化學交聯結合質譜技術 (chemical cross-linking coupled with mass spectrometry, CXMS)是近年來迅猛發展的一種檢測蛋白質結構和蛋白質相互作用的方法。隨着質譜儀器以及交聯數據搜索算法的發展，CXMS技術已經獲得了長足的進步。除此之外，新型交聯劑的開發也是推動該技術發展的重要方向之一。賴氨酸是一類含量豐富的氨基酸 (約7%)，CXMS技術中應用最為廣泛的交聯反應也是基於賴氨酸側鏈氨基的反應。現階段商業可得的賴氨酸交聯劑大多包含琥珀酰亞胺酯或亞氨酸酯活性基團，如雙琥珀酰亞胺辛二酸酯 (DSS)。雖然此兩類活性酯獲得了一定的應用，但其存在易水解而失效的缺陷。因此開發一類不水解、高選擇性的賴氨酸交聯劑具有重要意義。
基於此，為了進一步豐富交聯劑的種類，研究人員發展了一系列基於鄰苯二甲醛 (ortho-phthalaldehyde) 結構的賴氨酸選擇性交聯劑，命名為DOPA，DOPA交聯劑可以有效地連接蛋白質表面兩個賴氨酸殘基（如圖1）。尤其是DOPA2交聯劑在蛋白混合物上展現出較高的交聯反應效率（如圖2）。
圖1.DOPA交聯劑與賴氨酸特異性發生交聯反應
圖2.DOPA交聯劑在十個蛋白混合物中的交聯表現
研究人員進一步探究DOPA交聯劑性質時，發現DOPA交聯劑展現出了不水解、反應速度快、耐低溫、低pH和變性劑的特性，因此決定將其運用到蛋白質變性去摺疊過程中結構動態變化研究。在金黃色葡萄球菌核酸酶（SNase）、牛血清白蛋白（BSA）和牛胰腺核糖核酸酶A（RNaseA）變性去摺疊過程中，DOPA2捕捉到了蛋白從摺疊態到去摺疊態的轉換。如DOPA2捕獲了牛胰腺核糖核酸酶A（RNaseA）在8M尿素中的連續變性過程，再結合分子動力學模擬，獲得了RNaseA去摺疊中間體的構象集合（如圖3）。DOPA交聯劑的這些特點拓展了CXMS技術的應用範圍，使該技術研究蛋白質空間結構動態變化成為可能。
圖3.DOPA2交聯質譜技術分析RNaseA在8M尿素中的變性過程
雷曉光、董夢秋和唐淳為該論文共同通訊作者。董夢秋課題組王建華博士和雷曉光課題組唐毓良博士為該文章共同第一作者。該工作得到中國科學院精密測量科學與技術創新研究院龔洲博士，馬薩諸塞大學醫學院Rohit Jain博士，原董夢秋課題組博士譚丹，中科院生物物理所葉克窮研究員，北京生命科學研究所黃牛研究員、周宇博士，雷曉光課題組肖凡、李強博士以及雲南大學柳樹群教授的支持。上述研究得到科技部-國家重點研發計劃-蛋白質機器與生命調控專項、國家自然科學基金委、北京分子科學國家研究中心、北大-清華生命科學聯合中心、中科院和北京市卓越青年科學家計劃等科研項目和研究機構資助。
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