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為了合成具有構建鏡像生物系統目的的手性倒置核糖體,需要製備千鹼基長的鏡像核糖體RNA,這些RNA構成了鏡像核糖體的結構和催化核心,約占其分子質量的三分之二。

2022年10月27日,清華大學/西湖大學朱聽團隊在Science在線發表題為「Mirror-image T7 transcription of chirally inverted ribosomal and functional RNAs」的研究論文,該研究用化學方法合成了一個100千爾頓的鏡像T7 RNA聚合酶,使酶組裝的長鏡像基因的全長鏡像5S、16S和23S核糖體RNA能夠高效、忠實地轉錄。

該研究進一步開發了多功能鏡像T7轉錄系統的實際應用,如生物穩定鏡像核糖開關傳感器,無保護的長千鹼基L-RNA在水中的長期存儲,以及L-核酶催化的L-RNA聚合,以作為基礎RNA研究的模型系統。

另外,2022年6月6日,清華大學朱聽團隊在Nature Biotechnology(IF=55)在線發表題為「Directed evolution and selection of biostable L-DNA aptamers with a mirror-image DNA polymerase」的研究論文,該研究開發了一種「鏡像選擇」方案,用於定向進化和選擇具有鏡像 DNA 聚合酶的生物穩定 L-DNA 適體。該研究對結合天然人凝血酶的 L-DNA 序列進行迭代富集和鏡像聚合酶鏈反應 (PCR) 擴增,並結合變性梯度凝膠電泳 (DGGE) 分離單個適體和 L-DNA 合成測序以確定其序列。基於選定的 L-DNA 適體,該研究設計了生物穩定的凝血酶感應器和抑制劑,即使在存在快速降解 D-DNA 適體的人血清的情況下,它們也能在生理相關的富含核酸酶的環境中保持功能。總之,直接從大型隨機 L-DNA 文庫中鏡像選擇生物穩定的 L-DNA 適體極大地擴展了可以靶向的生物分子的範圍,拓寬了它們作為生物穩定感應器、治療和基礎研究工具的應用(點擊閱讀)。

2021年7月29日,清華大學朱聽團隊在Nature Biotechnology在線發表題為「Bioorthogonal information storage in L-DNA with a high-fidelity mirror-image Pfu DNA polymerase」的研究論文,該研究化學合成了分子量達90 kDa的大型鏡像蛋白質:鏡像Pfu DNA聚合酶,利用該高保真鏡像聚合酶組裝出千鹼基長度的長鏈鏡像DNA,並開發了基於鏡像DNA的信息存儲技術。該研究還利用環境水樣進行了生物正交性實驗,結果表明攜帶採樣地點信息的鏡像DNA在從清華園荷塘採集的水樣中存放一年後仍能被有效擴增,且其攜帶的信息仍能被準確讀取;而同樣存放條件下的天然DNA則在一天後即被完全降解,造成信息丟失。該研究展示了鏡像DNA在複雜自然環境中長時間儲存信息的能力及廣泛的適用性(點擊閱讀)。

在Louis Pasteur發現分子手性並提出手性倒置生命形式的160多年後,自然界中仍未發現鏡像生命。以D-氨基酸和L-核酸為構建單元的體外鏡像生物系統的實驗室實現(與自然手性的L-氨基酸和D-核酸相反)提供了獨特的機會,但仍然具有挑戰性。這項工作的一個重要部分是建立分子生物學中心教義的鏡像版本。在鏡像DNA複製、轉錄和逆轉錄之後,下一步是實現鏡像翻譯。這需要高質量的長L- RNA,如千鹼基長的鏡像核糖體RNA (rRNA),它構成了>2-MDa鏡像核糖體的結構和催化核心。
高質量長L-RNA的化學合成仍然很困難,因為傳統的磷酰化化學只允許高效合成60 ~ 70個核苷酸(nt)。克服這一限制的一種方法是通過鏡像聚合酶進行酶轉錄。之前使用鏡像solfataricus P2 DNA聚合酶IV (d-Dpo4-5m-Y12S)的Y12S突變體轉錄120 nt鏡像大腸桿菌(E. coli) 5S rRNA。此外,交叉手性核酶已被開發用於聚合L-RNA。然而,這兩種系統都存在效率低、保真度低的問題,而且需要單鏈L-DNA或L-RNA模板,這些模板很難從聚合的L-RNA中製備和移除。
合成的自然手性和鏡像T7 RNA聚合酶(圖源自Science )
另一種方法是合成噬菌體T7 RNA聚合酶的鏡像版本,由於其優異的效率、保真度和啟動子特異性,它是實驗室中廣泛用於體外和體內轉錄的主要酶。T7 RNA聚合酶使用雙鏈DNA模板進行轉錄,鏡像版本的DNA模板可以通過鏡像聚合酶鏈反應(PCR)很容易組裝。然而,全長T7 RNA聚合酶包含883個氨基酸,超出了固相多肽合成(SPPS)和天然化學連接(NCL)相結合的化學蛋白質合成的一般大小限制,使各種鏡像酶通常小於~400個氨基酸,或~ 45kda。
最近,研究人員應用了分裂蛋白設計和系統異亮氨酸取代來促進90-kDa高保真鏡像Pfu DNA聚合酶的全化學合成,從而實現了1.5 kb鏡像16S rRNA基因的精確組裝。儘管開發了一種用於轉錄RNA的突變Pfu DNA聚合酶,但轉錄效率不佳,且製備長單鏈L-DNA模板困難,可能使這種方法不切實際。研究人員開始使用分裂蛋白設計和系統異亮氨酸替代合成100 kda鏡像T7 RNA聚合酶,並測試其高效、忠實轉錄高質量長L-RNA的能力,如鏡像5S、16S和23S rRNA和各種功能的L-RNA。
參考消息:
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abm0646

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