目前，放療是腫瘤患者最常規且有效的治療方式之一，約60%癌症患者會接受放療[1]。
隨着放療技術設備及影像技術的更迭，放療的有效性及可靠性越來越高。儘管如此，放療過程中對於健康組織的誤傷仍然不可避免。
組織損傷首先帶來炎症反應，但後期就需要啟動組織修復。組織修復（再生）需要抑制炎症免疫反應，這跟腫瘤免疫抑制的微環境相似。然而，放射損傷-修復微環境與腫瘤轉移之間的關係仍不清楚。
近日，由倫敦瑪麗女王大學Ilaria Malanchi領銜的研究團隊在《自然•癌症》發表重要研究結果。
他們發現小鼠健康肺部被輻射之後，會導致大量外周循環的中性粒細胞浸潤到損傷部位，產生與組織修復相關的中性粒細胞反應，並激活肺上皮細胞Notch信號通路介導的促腫瘤肺轉移。用中性粒細胞脫顆粒抑制劑Nexinhib20，或者Notch抑制劑DAPT能夠有效抑制中性粒細胞介導的腫瘤轉移。
論文首頁截圖
Malanchi團隊的前期研究表明，乳腺癌發生肺轉移時，肺組織會發生一種組織再生的現象[2]。隨後，Malanchi團隊分析了以往的基礎研究及臨床研究數據，結果發現接受放療的患者，乳腺癌病灶同側的肺組織腫瘤轉移的現象更為常見[3,4]。
因此，Malanchi團隊想知道放療對健康組織的誤傷是否可能有助於腫瘤細胞的轉移。如果是，他們還想知道背後的分子機制是什麼。
為了回答這個假設，Malanchi團隊用輻射（單次13Gy）肺部造成的急性肺損傷，結合移植腫瘤細胞的小鼠模型，來探究健康組織損傷與腫瘤轉移的關係。
在輻射造成小鼠急性肺損傷後，無論是小鼠原位乳腺移植腫瘤細胞，還是尾靜脈直接植入腫瘤細胞，研究人員都發現：移植14-21天後，輻射組小鼠肺部的腫瘤數目、肺組織切片展示的腫瘤面積都急劇增加。
為了排除個體差異，他們精準輻射小鼠右側肺部造成損傷，隨後尾靜脈植入腫瘤細胞。實驗數據表明，小鼠右側肺葉的腫瘤數目顯著高於未輻照的左側肺葉。
a: 肺部輻射/移植腫瘤細胞實驗流程；b-c: 輻射促進腫瘤細胞轉移；
j: 右側肺部輻射/移植腫瘤細胞實驗流程；k: 右側肺部轉移腫瘤多於左側
在輻射造成小鼠急性肺損傷後，Malanchi團隊還通過組織切片染色證實輻射的確會帶來組織損傷，如DNA的斷裂。此外，他們還有個意外發現：進入到損傷肺部的中性粒細胞顯著增加，且呈現為多分葉核和顆粒蛋白含量增加的炎症活化型細胞形態。
為了驗證浸潤的中性粒細胞是否參與促進腫瘤細胞轉移到受損組織定殖，Malanchi團隊採用一正一反兩種策略。
先來看第一種策略。在輻射前一天開始直到實驗結束，他們每天給小鼠腹腔注射抗Ly6G抗體，清除小鼠體內的中性粒細胞。在輻射7天後，他們又通過尾靜脈注射，給小鼠移植腫瘤細胞。在移植腫瘤細胞7天後，他們發現清除中性粒細胞能夠有效抑制轉移到肺部腫瘤的生長。
在第二種策略中，他們採用了G-csf（粒細胞刺激因子）敲除小鼠作為腫瘤移植受體鼠。從輻射前一天開始，每隔一天共4次皮下注射外源重組粒細胞刺激因子（rGCSF），給G-csf敲除小鼠補充GCSF。在輻射7天後，進行尾靜脈腫瘤細胞移植。在移植腫瘤細胞7天後，他們發現注射rGCSF能夠促進腫瘤轉移到肺部。
a: 中性粒細胞清除/輻射-腫瘤移植實驗流程；b: 清除中性粒細胞抑制腫瘤轉移
e: G-csf敲除小鼠/輻射-腫瘤移植實驗流程；f-g: rGCSF促進腫瘤轉移
基於以上研究成果，Malanchi團隊推測輻射損傷健康肺組織，能夠預激活浸潤的中性粒細胞，進而改造肺部微環境利於腫瘤細胞轉移定殖。
為了驗證這種猜想，Malanchi團隊設計了一個二次移植實驗：先將供體小鼠肺部進行輻射損傷，7天後用抗Ly6G磁珠富集分離出肺部浸潤的中性粒細胞。將這些已經預激活的中性粒細胞轉移到正常小鼠體內，再通過尾靜脈注射腫瘤細胞。
結果顯示，移植預激活中性粒細胞的小鼠肺部腫瘤數目顯著高於對照組。這個實驗結果表明：這群預激活的中性粒細胞具備將肺部微環境改造成有利於腫瘤轉移的能力。
a: 中性粒細胞二次移植實驗流程
b-d: 輻射預激活中性粒細胞促進腫瘤轉移
為了探究預激活的中性粒細胞影響肺部的具體靶細胞群，Malanchi團隊藉助抗Ly6G抗體清除中性粒細胞，然後通過流式分選肺上皮細胞（CD45-CD31-Ter119-EpCAM+）、間充質細胞（CD45-CD31-Ter119-EpCAM-），並進行RNA-Seq測序。
主成分聚類分析顯示：輻射加注射抗Ly6G抗體實驗組的樣本與單純輻照實驗組的樣本不能夠聚類在一起。這表明清除中性粒細胞對輻射處理的肺上皮細胞影響非常大。再結合體外肺類器官培養模型實驗，證實了預激活的中性粒細胞能夠更好地激活肺上皮細胞。
為了探究預激活的中性粒細胞對肺上皮細胞功能的影響，Malanchi團隊深入分析了肺上皮細胞RNA-Seq數據。結果發現肺上皮細胞的Notch信號通路被預激活的中性粒細胞活化。
e: 肺上皮細胞轉錄組測序實驗流程
f: 中性粒細胞直接影響肺上皮細胞轉錄組學聚類
為了了解這群Notch信號通路異常活化的肺上皮細胞是否參與到腫瘤細胞轉移中，Malanchi團隊構建了他莫昔芬誘導的Notch在II型肺泡細胞特異性過表達的轉基因小鼠（Sftpc-CreER; Rosa26NICD-IRES-GFP）。隨後讓這種小鼠與自髮乳腺癌小鼠（MMTV-PyMT）交配，獲得能夠自發原位乳腺腫瘤，且能被他莫昔芬特異性誘導II型肺泡細胞活化Notch信號通路的小鼠模型。
藉助於上述小鼠模型，他們發現Notch過度活化的II型肺泡細胞確實能夠促進乳腺癌的肺轉移。他們還藉助單細胞測序分析證實，輻射後的肺上皮細胞在腫瘤細胞到達之前，Notch信號通路已經被過度活化。
鑑於幹細胞轉錄因子Sox9是Notch1的下游靶基因[5]，Malanchi團隊想知道在Notch信號通路過度活化微環境中，腫瘤細胞自身的乾性是否被增強。他們發現輻射確實促進了Notch信號的傳遞和轉移腫瘤細胞的幹細胞化。
c-f: Notch過度活化的II型肺泡細胞促進原位乳腺癌肺轉移
那麼，故事講到這個份上，就必須回到本研究的主角中性粒細胞。這群預激活的中性粒細胞又是如何影響到肺上皮細胞的呢？
Malanchi團隊根據前面發現的中性粒細胞胞內顆粒蛋白增加現象，猜測有可能是這些顆粒蛋白的釋放介導了上述過程？因此，他們提出通過抑制中性粒細胞的脫顆粒過程，來探究顆粒蛋白不再釋放是否會影響腫瘤的轉移。
他們發現，脫顆粒抑制劑Nexinhib20的確可以逆轉輻射損傷肺部由中性粒細胞介導的促腫瘤轉移現象。更進一步，他們還採用中性白細胞彈性硬蛋白酶（Ela2）基因敲除小鼠模型，得到了與抑制劑Nexinhib20相同的效果。
那麼，如果抑制肺上皮細胞過度活化的Notch信號通路，是否也能夠達到逆轉輻射損傷肺部由中性粒細胞介導的促腫瘤轉移效果呢？
研究人員採用γ-分泌酶抑制劑DAPT（Notch抑制劑）處理肺輻射損傷小鼠，發現的確能夠有效抑制腫瘤乾性，進而抑制腫瘤的轉移、生長。
a: 小鼠DAPT給藥/輻射-腫瘤移植實驗流程
b: DAPT抑制腫瘤轉移
至此，本研究藉助輻射急性肺損傷結合自發/移植腫瘤模型，驗證了輻射損傷正常組織（肺部）有利於腫瘤轉移（肺部）的假說。進一步找到了中性粒細胞（顆粒蛋白）-肺上皮細胞（Notch信號路）-腫瘤乾性（Sox9）這條隱秘的「利益」信息傳導鏈條。藉助抑制劑Nexinhib20、DAPT阻斷傳導鏈條能夠有效的實現逆轉，具有一定的臨床轉化意義。
總的來說，Malanchi團隊的研究表明，高水平輻射對健康肺組織的微環境有深刻影響，這種影響增加了癌症轉移到肺部的潛力。更重要的是，Malanchi團隊發現，受輻射刺激的中性粒細胞是促進癌症轉移的關鍵。
需要指出的是，在Malanchi團隊的實驗中，暴露於輻射下的健康組織體積遠大於臨床放療。因此並不能基於這個研究得出放療促進癌症轉移的結論。但是，這個研究發現了輻射對中性粒細胞的影響，而且放療增強轉移的能力依賴於中性粒細胞的脫顆粒作用。中性粒細胞產生的外泌體有可能影響其他區域的微環境，助力癌細胞的轉移。因此，基於這個研究，我們有必要關注放療對患者體內中性粒細胞的影響。
最後，我們想來討論下這個研究實驗設計的局限性。
在臨床上，在既有原發腫瘤又有肺部轉移瘤時，患者已經與腫瘤共存很長一段時間了。此時，採取放射治療對健康組織的誤傷促進腫瘤的轉移，很難區分是已存在機體的腫瘤直接對肺損傷的微環境更適應（因為裡面的免疫細胞也都被無差別損傷了），還是損傷帶來炎症（中性粒細胞活化）及後期損傷修復影響微環境造成的，甚至是放射治療帶來的機體應激反應，亦或是幾者都存在。這與Malanchi團隊設計的先損傷、再移植外來腫瘤細胞的實驗模擬是完全不一樣的概念。因為，在實驗設計中的輻照帶來肺損傷之前，小鼠體內是沒有腫瘤細胞的。因此，該研究團隊在討論部分也強調了這種急性損傷-移植模型具有一定的局限性。
此外，清除中性粒細胞（或抑制脫顆粒過程），對中性粒細胞承擔的免疫防疫的傷害是很大的，因為人體不但面對腫瘤，還有細菌、真菌、支原體等微生物的入侵。而根據已有實驗數據、背景知識的解讀，肺上皮細胞活化Notch信號通路不是無緣無故的，是要參與肺上皮細胞損傷修復的。如果抑制Notch信號通路，腫瘤可能來的少了些，自身損傷的修復也將要明顯的延緩。而慢性遷延性炎症帶來的後果是難以預估的，比如出現肺纖維化將會導致肺功能下降。這些不足之處也將極大的限制臨床轉化應用。
這些有意思的問題值得大家一步討論和研究。癌症號稱「永不癒合」的傷口，那麼類似這種慢性「損傷」對於正常組織微環境是否存在持續性的改造？除中性粒細胞外，其他組織定居型巨噬細胞是否參與其中？
期待後續更多的研究成果。
參考文獻：
[1] Wirsdörfer F, Jendrossek V. The Role of Lymphocytes in Radiotherapy-Induced Adverse Late Effects in the Lung. Front Immunol. 2016; 7: 591.
[2] Ombrato L, Nolan E, Kurelac I, et al. Metastatic-niche labelling reveals parenchymal cells with stem features [published correction appears in Nature. 2019 Nov;575(7784):E8]. Nature. 2019; 572 (7771): 603-608.
[3] Vicini FA, Kestin L, Huang R, Martinez A. Does local recurrence affect the rate of distant metastases and survival in patients with early-stage breast carcinoma treated with breast-conserving therapy? Cancer. 2003; 97 (4): 910-919.
[4] Kuonen F, Secondini C, Rüegg C. Molecular pathways: emerging pathways mediating growth, invasion, and metastasis of tumors progressing in an irradiated microenvironment. Clin Cancer Res. 2012; 18 (19): 5196-5202.
[5] Meier-Stiegen F, Schwanbeck R, Bernoth K, et al. Activated Notch1 target genes during embryonic cell differentiation depend on the cellular context and include lineage determinants and inhibitors. PLoS One. 2010; 5 (7): e11481.
責任編輯丨BioTalker
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