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通過siRNA精準調控靶基因的表達是近年來疾病治療相關研究的熱點方向。已表現出的顯著治療效果和仍存在的改進空間激勵着大量研究團隊的不斷探索。siRNA應用的難點仍然是其遞送效率的不足，包括難入胞性、酶降解、溶酶體逃逸等挑戰。四面體框架核酸 (tFNA) 作為一種3D的DNA納米結構，基於其高效的自組裝合成方式、尺寸的可控性和可定製式優化的多功能修飾等優勢，在寡核苷酸遞送中獲得了廣泛的關注，具有極高的研究和應用前景。

近日，四川大學華西口腔醫學院蔡瀟瀟教授課題組在《Advanced Materials》期刊上發表了題為「A Lysosome-activated Tetrahedral Nanobox for Encapsulated siRNA Delivery」的研究型文章（DOI:10.1002/adma.202201731）。該研究未採用常規粘性末端搭載目標siRNA，而是通過兩端互補配對的方式將靶siRNA嵌入到載體內部，利用了tFNA固有的穩定空間提供保護作用。在保護性遞送的基礎上，進一步通過加入富C（Cytosine-rich）序列來增加pH響應性開關，使得該載體在進入細胞後可通過溶酶體的富氫離子特性將結構打開，從而獲得目的siRNA的可控性釋放。該動態DNA納米盒獨特的搭載方式能夠顯著提高被遞送siRNA的抗酶降解和抗血清降解能力，並提供足夠的「鎖定」能力避免在遞送過程中出現貨物-載體意外分離。此外，該富C序列可以在溶酶體生理pH（約4.5-5.5）下，形成i-motif四鏈結構，使納米盒從關閉狀態轉變為開放狀態，配合37℃的生理溫度驅動，最終實現siRNA主動釋放。該研究對所設計的動態DNA納米盒進行了細胞內追蹤，從入胞、主動釋放到溶酶體逃逸、細胞內siRNA的成熟前剪切，證實了所包裹搭載的siRNA能夠突破從胞外到胞質內的多層屏障，最終實現靶mRNA的有效沉默。研究設計的tFNA邊長為30 bp，可以容納絕大多數siRNA的尺寸，能夠為其他常規長度 siRNA 的沉默遞送提供新思路，在小RNA遞送系統領域具有廣闊的前景。


圖1動態DNA納米盒的設計與表徵 (a) 動態DNA納米盒合成示意圖 (b) 2% 瓊脂糖電泳凝膠圖 (c) 5% PAGE結果通過熒光淬滅反應證實所搭載siRNA成功嵌入納米盒的內部空間(d) 動態DNA納米盒的溶酶體響應性開關示意圖 (e) 通過熒光淬滅反應證實開關在不同pH下的打開程度（pH = 8.0、7.0、6.0、5.5、5.0、4.5 和4.0） (f)對比動態DNA納米盒(含有富C序列) 和 靜態DNA納米盒(對應隨機序列，無pH響應性) 在 pH 8 和 pH 5 條件下的結構變化。


圖2動態DNA納米盒所包裹的siRNA的穩定性與釋放能力評估(a-f) 評估了游離siRNA和動態DNA納米盒搭載的siRNA對RNA酶A降解和血清降解的抵抗性。證實了嵌入性包裹的方式能夠為siRNA提供明顯的保護作用(g-j) 對比動態DNA納米盒(嵌入式搭載目的siRNA) 和常規tFNA (黏性末端式搭載目的siRNA) 在不同pH和不同溫度下遞送和控釋能力。

圖3 動態DNA納米盒-siRNA在巨噬細胞內的軌跡追蹤(a-c) 流式細胞術檢測和分析游離siRNA以及常規tFNA、動態DNA納米盒、Lipofectamine3000搭載siRNA的入胞情況(d-e) 共聚焦顯微鏡下觀察pH響應性開關在入胞後溶酶體內的打開情況（紅色箭頭指示沒有Cy3信號重疊的單獨Cy5信號。白色箭頭指示伴隨Cy3信號重疊的Cy5信號）(f) 共聚焦顯微鏡下觀察孵育動態DNA納米盒-siRNA3小時、6小時、12小時和24小時後，巨噬細胞中siRNA的溶酶體逃逸情況（紅色箭頭指示尚未從溶酶體內逃逸的siRNA與溶酶體發生熒光信號的重疊，白色箭頭指示已從溶酶體內逃逸的siRNA的Cy5信號） (g) 通過小RNA qPCR分析的游離siRNA以及常規tFNA、動態DNA納米盒、Lipofectamine3000搭載的siRNA在細胞內被剪切成為成熟siRNA後，siRNA正義鏈的相對水平。


圖4 動態DNA納米盒搭載抗TNFα-mRNA的siRNA在巨噬細胞中的基因沉默效果(a) 示意圖顯示了巨噬細胞內動態DNA納米盒-siRNA發揮基因沉默作用的過程。 (b-c) qPCR和ELISA分別從基因水平和蛋白水平分析了游離siRNA以及常規tFNA、動態DNA納米盒、Lipofectamine3000搭載的siRNA轉染後，炎症狀態下細胞內TNFα mRNA 表達水平以及TNFα的分泌水平(d-e) 熒光顯微鏡下觀察巨噬細胞中活性氧的表達水平。


圖5. 動態DNA納米盒搭載抗TNFα-mRNA的siRNA在小鼠體內的基因沉默效果(a) 小鼠腹腔注射動態DNA納米盒-siRNA後，在不同時間（30分鐘、1小時、2小時、3小時、6小時、12小時和24小時）進行體內熒光分布和離體器官的熒光圖像拍攝(b) C57BL/6 小鼠的血清、腹膜液和氣管灌洗液內的TNFα蛋白水平(c) 組織器官（肝臟、脾臟和肺部）中TNFα 的mRNA水平 (d) 肝臟內TNFα陽性細胞分布情況(e) 肝臟和血清中的ALT活性分析。

這些結果證實納米盒的四面體結構為目的siRNA提供了顯著的保護作用以及運輸過程中的遞送穩定性。此外，溶酶體響應的動態開關允許目的siRNA在生理溫度下主動地可控地釋放。體外實驗和體內實驗均實現了對靶標TNFα mRNA的優異的基因沉默效果。動態DNA納米盒被認為可為siRNA用於疾病治療提供一個動態的pH限制的遞送系統，並且可以成為其他小RNA載體設計的可擴展思路。

原文鏈接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202201731

作者簡介





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四川大學華西口腔醫學院在讀博士生高陽為該文章的第一作者，通訊作者為四川大學華西口腔醫學院蔡瀟瀟教授

蔡瀟瀟，女，教授，主任醫師，博士生導師，科研工作主要從事口腔組織工程與核酸納米材料研究；臨床工作主要從事口腔種植學工作。發表第一/通訊作者SCI論著90篇（累積影響因子578），包括Advanced Materials、Small、Bioactive Materials、Bone Research等，封面論文11篇，ESI高被引論文3篇，最高影響因子30，影響因子＞10的7篇，影響因子＞6的57篇，主編英文專著2部，累計SCI他引2900餘次，H-Index=31，擔任Journal of Biomedical Nanotechnology（SCI）副主編，6本SCI期刊編委，擔任International College of Dentistry Fellow。主編英文專著2部。主持國家自然科學基金5項。獲得全國百篇優秀博士論文提名獎、四川省優秀博士論文、7次全國BITC種植病例大賽金獎等。

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