水凝膠是由親水性聚合物形成高度水合的三維網絡，已被廣泛用作控制藥物釋放的支架和組織工程中細胞外基質的替代物。利用各種功能分子對水凝膠進行化學改性，製備功能化水凝膠以發揮如細胞黏附、抗菌等所需要的功能，這些功能化水凝膠可以通過兩種途徑製備：在固化前用功能分子對聚合物進行改性和在固化期間功能分子與預先修飾的特定反應點的修飾（圖1a）。然而，目前製備功能化水凝膠通常需要將活性基團（如疊氮化物）加入到基質當中，然後通過活性基團將功能分子與基質連接起來。對於含有特定類型反應基團（如疊氮）的底物，只有含有特定反應基團（如炔）的分子才能進行下一步的功能化步驟，換句話說，研究者們需要合成具有特定結合位點的預修飾聚合物和具有匹配結合位點的功能分子來製備特定類型的功能化水凝膠（圖1a），這大大限制了功能化水凝膠開發的靈活性。因此，建立一種通用的策略來製備不同類型的功能化水凝膠，而不需要單獨使用預先反應的基團來修飾聚合物，是目前亟待解決的挑戰。來自華東理工大學劉潤輝教授團隊開發了帶有黏附性的三肽分子，僅簡單一步就實現了對濕凝膠的功能化。
研究者注意到，沙堡蠕蟲可以分泌黏附蛋白，將濕潤的礦物顆粒（沙子、貝殼等）緊密的粘合在一起，而Pc-1是其中關鍵性的黏附蛋白，其中3，4-二羥基-L-苯丙氨酸（DOPA）與賴氨酸的摩爾比為1:1（圖1b）。這啟發研究者設計了DOPA與賴氨酸摩爾比為1:1的黏附性短肽。由於C端賴氨酸上的羧酸基團減弱了多肽的黏附功能，因此研究者將C端賴氨酸簡化為二丁胺（dibutylamine，Dba），最終設計為二丁胺-DOPA-賴氨酸-DOPA這種三肽（記為DbaYKY）。DbaYKY三肽可以在水環境中將功能分子直接修飾在水凝膠的表面和內部，從而實現水凝膠的多功能化，如抗菌、細胞黏附和傷口癒合（圖1c）。
研究者通過4步簡單的合成獲得了克級以上末端氨基的DbaYKY黏附分子引發劑，此外還介紹了該黏附分子的固相合成方法，展示了該分子可以大量合成，並方便更多的實驗室和公司來擴展它的應用。末端氨基的DbaYKY黏附分子可以直接用作α-氨基酸與N-羧酸酐（NCA）聚合的引發劑（圖2a），也可以進一步通過一步合成分別獲得原子轉移自由基聚合（ATRP）引發劑、可逆加成-斷裂鏈轉移聚合（RAFT）引發劑和β-內酰胺類陰離子開環聚合（AROP）引發劑等（圖2a），從而進行各類聚合反應。隨後研究者利用這些引發劑合成了不同類型的8種聚合物（分別記為Pol-1至Pol-8）（圖2b-e）。這些聚合物分別具有不同的功能，但同時都保留了DbaYKY黏附分子，表明該黏附分子理論上可以和絕大多數化合物或聚合物相連。
接着研究者探究了該黏附分子的黏附強度。研究者將DbaYKY黏附分子接在原子力顯微鏡（AFM）的探針上（圖3a），單分子力譜（SMFS）測試結果表明DbaYKY與PEG水凝膠的相互作用力中位數為223pN，分布範圍為40-760 pN，代表性力-距離曲線和破裂分布直方圖如圖3b所示。為了探究DbaYKY黏附分子中氨基和鄰苯二酚基團的重要性，研究者分別合成了不帶氨基的YY，減少一個氨基的YKY，減少一個DOPA的KYK，以及打亂氨基酸排序的KKYY。結果顯示YY的黏附力中位數僅為82pN（圖3c），YKY為164pN（圖3d），說明氨基對多肽的黏附力起到重要的協同作用；KYK的黏附力中位數為172 pN（圖3e），比DbaYKY弱，說明了兩個DOPA的必要性；KKYY的黏附力中位數為203 pN（圖3f），與DbaYKY相比無統計學差異，說明氨基酸的排序對分子的黏附力無明顯的影響。這些結果表明，DbaYKY的兩個氨基基團（來自Dba和賴氨酸）和兩個鄰苯二酚基團（來自兩個DOPA）對黏附分子的黏附性能是十分重要的，這與沙堡蠕蟲分泌的黏附蛋白Pc-1中DOPA：賴氨酸為1：1是相通的。
隨後研究者演示了DbaYKY黏附分子如何簡單有效的實現一步法改性水凝膠。將PEG水凝膠浸沒在含有DbaYKY黏附分子的聚合物（Pol-1，Pol-3和Pol-7）溶液當中（圖4a），並對修飾前後的水凝膠進行X射線光電子能譜（XPS）和衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）進行表徵，修飾前後結果的變化均證實功能聚合物已成功黏附在水凝膠的表面（圖4b-4e）。在對照組中，使用不帶黏附基團的Pol-9，Pol-10和Pol-11進行同樣的方法對PEG水凝膠進行修飾，發現缺乏黏附基團的聚合物無法實現水凝膠的功能化修飾（圖4b-4e），因此聚合物與水凝膠的物理纏結是可以忽略不計的，這進一步表明先前聚合物的成功修飾是黏附基團起主導作用。用Kaiser試驗檢測用Pol-7（帶DbaYKY黏附分子）或Pol-11（不帶DbaYKY黏附分子）改性的PHEMA水凝膠中的氨基聚合物，發現只有Pol-7改性的PHEMA水凝膠變成了深紫色，而Pol-11「改性」的PHEMA水凝膠和單純的PHEMA水凝膠仍然保持無色（圖4f）。這些研究表明，通過DbaYKY基團對水凝膠進行功能化改性是成功的。
最後研究者從多個角度展示了這種一步法普適性修飾水凝膠策略的應用。抗菌性能可以通過結合了有效抗菌劑的聚合物修飾單純水凝膠來實現。研究者將具有抗菌作用的Pol-1和Pol-3修飾到PEG和PVA水凝膠上，並分別以大腸桿菌（E. coli）和金黃色葡萄球菌（S. aureus）檢測了功能化水凝膠的抗菌性能（圖5a）。Pol-1和Pol-3的修飾使得功能化水凝膠對兩種細菌的殺傷率達到99%以上（圖5b-c）。然後，研究者再次向這些水凝膠中加入細菌。Pol-1或Pol-3修飾的PEG或PVA水凝膠與細菌溶液孵育2.5h後，殺滅率均>95%，多數情況下殺滅率>99%（圖5d），證實了水凝膠功能的可重複利用。將支持細胞黏附的聚合物Pol-7修飾到PEG、PHEMA、PSBMA、PVA和ALG水凝膠上，隨後在水凝膠上種植3T3成纖維細胞，一天後的熒光圖像顯示Pol-7的修飾使得原本抗黏附的水凝膠均轉變為促進細胞的黏附和鋪展的水凝膠（圖6a）。3T3成纖維細胞在Pol-7改性PEG水凝膠上1天、3天和7天的熒光圖片也證實了這一點（圖6b）。研究者還比較了Pol-7和Pol-11修飾後細胞在PHEMA水凝膠上的黏附性能，觀察到細胞與Pol-7（帶DbaYKY黏附分子）修飾的PHEMA水凝膠的顯著黏附；與之形成鮮明對比的是，Pol-11（不帶DbaYKY黏附分子）「改性」的PHEMA水凝膠不能支持細胞黏附，這再一次證實了DbaYKY三肽的黏附功能（圖6c）。細胞與水凝膠的黏附對創傷修復十分重要，因此研究者利用大鼠皮膚全層創傷模型研究了Pol-7功能化PVA水凝膠促進傷口癒合的能力。創面的癒合情況評分以及HE染色結果顯示Pol-7改性PVA水凝膠可使表皮完全恢復，而空白對照組和未修飾PVA水凝膠治療組創面癒合不完全（圖7a-d），證實了DbaYKY三肽一步修飾水凝膠策略的成功。除此之外，研究者發現通過修飾凍干後的水凝膠可以實現表面和內部的整體功能化（圖6c-d），進一步擴展了該修飾方法的適用性。
綜上所述，研究者受沙堡蠕蟲啟發製備了DbaYKY黏附三肽，能夠成功引發多種類型的聚合從而製備出以該黏附分子為端基的功能性聚合物，並直接修飾水凝膠，且功能化程度具有可控、穩定等特點。這一快捷簡單、普遍適用的水凝膠功能化策略為水凝膠材料的製備提供了新的思路，在生物醫學領域有着廣闊的應用前景。
本研究由來自華南理工大學的劉潤輝教授團隊完成，並於2021年11月3日在線發表於Nature Communication。
論文信息：Donghui Zhang, Jingjing Liu, Qi Chen, Weinan Jiang, Yibing Wang, Jiayang Xie, Kaiqian Ma, Chao Shi, Haodong Zhang, Minzhang Chen, Jianglin Wan, Pengcheng Ma, Jingcheng Zou, Wenjing Zhang, Feng Zhou,Runhui Liu*.A sandcastle worm-inspired strategy to functionalize wet hydrogels.Nat Commun. 2021;12(1): 6331.
供稿：朱壯
審校：朱彩虹
編輯：劉長江
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