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成簇的規則間隔短回文重複序列 (CRISPR)及其CRISPR相關蛋白 (Cas)構成了一個多樣化的適應性細菌免疫系統家族，除了作為脫氧核糖核酸 (DNA)編輯的寶貴工具外，還成為轉錄組工程的有前途的平台。在基於CRISPR能夠干擾RNA的技術中，Cas13是一種可編程的2類VI型CRISPR效應蛋白，能夠自然結合和切割單鏈RNA，因此可以被用於原核和真核細胞中的RNA靶向。Cas13蛋白可以通過一個工程化的CRISPR RNA (crRNA)導向分子被導向一個獨特的RNA序列，該分子編碼一種可編程的間隔序列，該序列通過RNA-RNA鹼基互補介導靶接合。當與靶序列結合時，Cas13經歷構象變化，激活其內在核糖核酸酶 (RNase)活性，並導致複合RNA的裂解 (圖1A)。2022年1月22日，來自美國伊利諾伊大學的Thomas Gaj及其團隊在Sci Adv (IF: 13.116)雜誌上發表名為Targeted gene silencing in the nervous system with CRISPR-Cas13的研究[1]。我們試圖確定CRISPR-Cas13是否可被遞送至中樞神經系統 (CNS)以沉默神經變性相關基因。更具體地說，我們首先詢問來自黃瘤胃球菌XPD3002中的Cas13d核酸酶 (RfxCas13d)是否可用於靶向超氧化物歧化酶1 (SOD1)，這是一種普遍表達的金屬酶，其突變可導致肌萎縮性脊髓側索硬化症 (ALS)，一種以脊髓和大腦中運動神經元選擇性喪失為特徵的快速進行性麻痹性疾病。鑑於其在ALS中的致病作用，通過基因沉默降低突變SOD1的表達已成為治療該疾病的一種有前景的策略。RfxCas13d沉默SOD1可改善ALS齧齒動物模型的結局接下來，我們試圖確定RfxCas13d通過AAV載體體內遞送至脊髓後，是否能夠對SOD1連接的ALS小鼠模型提供治療益處。雖然運動神經元在SOD1-ALS中選擇性缺失，但降低這些細胞中突變SOD1的表達只會延遲疾病的發作，而降低其在星形膠質細胞 (一種參與神經炎性反應的膠質細胞)中的表達會顯著減慢疾病的整體進展。因此，我們試圖將RfxCas13d遞送至脊髓星形膠質細胞，這是一種可以被AAV9有效靶向成年小鼠的細胞類型。為此，我們對60至65日齡的G93A-SOD1小鼠進行了注射，這些小鼠攜帶約25個人類突變的SOD1G93A轉基因，並通過編碼RfxCas13d的AAV9載體與SOD1靶向crRNA (AAV9-RfxCas13d-hSOD1)或非靶向crRNA (AAV9-RfxCas13d-NTG) 一起經腰椎腦脊液注射 (圖2A和B)，從而發展出一種出現ALS的特徵的侵襲性疾病，其特徵包括運動神經元變性、肌肉萎縮和癱瘓。圖2. RfxCas13d改善了G93A-SOD1小鼠的結果接下來，我們試圖確定RfxCas13d靶向在CNS中的普遍適用性。為此，我們問及RfxCas13d是否可用於敲除HTT (一種N末端附近有polyQ區的蛋白質，當擴增超過37個重複序列時，會導致HD，一種以紋狀體神經元缺失為特徵的進行性且最終致命的神經退行性疾病)。鑑於突變型HTT病與HD之間的因果聯繫，能夠降低突變型HTT基因表達的模式有具有減緩該疾病的臨床進展的潛力。基於RfxCas13d對SOD1的多功能性和靈活性，我們僅設計了四個crRNAs，分別靶向人類HTT (hHTT) mRNA外顯子1相對應的序列，包括polyQ編碼重複擴增的上游和下游 (圖3A)。然後，我們使用先前描述的編碼hHTT基因外顯子1的報告質粒，將94Q與青色熒光蛋白融合 (CFP)，以評估HEK293T細胞中crRNAs的沉默活性 (圖3A)。該報告基因的表達受四環素應答元件控制，該元件由四環素控制的反式激活蛋白激活。因此，在該系統中，HTT外顯子1的表達與CFP熒光相關聯。鑑於其在紋狀體中轉導神經元的能力，我們選擇使用AAV1在體內遞送RfxCas13d。因此，我們向4周齡R6/2小鼠紋狀體中注射了編碼RfxCas13d的AAV1載體，其中含有HTT靶向crRNA (AAV1- RfxCas13d-hHTT，左半球)或非靶向crRNA (AAV1- RfxCas13d-NTG，右半球)。分娩後4周，我們對解剖的紋狀體組織中人類突變HTT蛋白的豐度進行了定量。根據Western blot結果並與對照組織比較，我們測量到在注射了AAV1-RfxCas13d-hHTT的半球中人類突變HTT蛋白減少~ 60% (P < 0.05) (圖4A)，這一發現得到了qPCR的證實，結果顯示，與對照組相比，治療半球中hHTT mRNA的相對量降低了45% (P < 0.05) (圖4B)。圖4. RfxCas13d可降低HD小鼠模型腦內HTT蛋白含量CRISPR-Cas13效應因子憑藉其可編程性和通過固有的RNase活性裂解靶RNA的能力，可用於敲除哺乳動物細胞中的靶基因表達。在本研究中，我們證明了RfxCas13d是一種Cas13效應因子，其結構緊湊，足以與crRNA表達盒一起容納在單個AAV載體顆粒中，可以被編程為靶向 (i) SOD1，一種其突變與ALS的遺傳形式相關聯的蛋白質，和 (ii) HTT，一種在其N末端突變攜帶polyQ延伸擴增時導致HD的蛋白質。因此，我們的結果表明，RfxCas13d是抑制基因表達的通用平台。https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abk24851.Powell Jackson E,Lim Colin K W,Krishnan Ramya et al. Targeted gene silencing in the nervous system with CRISPR-Cas13.[J] .Sci Adv, 2022, 8: eabk2485.2022年醫藥加精品學習班檔期
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