近期，Nature 在同一天上線了兩篇關於光酶催化[2+2]環加成反應的文章，分別是英國曼徹斯特大學Anthony P. Green教授團隊的「A Designed Photoenzyme for Enantioselective [2+2]-Cycloadditions」 [1]，以及華中科技大學鍾芳銳教授、吳鈺周教授團隊和西北大學陳希教授團隊合作的「Enantioselective [2+2]-cycloadditions with triplet photoenzymes」 [2]。兩篇文章都提到了「三重態光酶」概念，並將其成功應用於光化學對映選擇性[2+2]環加成反應。
[2+2]-環加成反應是經典的光化學反應之一，可用於四元環化合物的構建，但是[2+2]-環加成反應由於基態軌道對稱性不匹配，因而是熱禁阻反應（圖1A）。近年來，化學家通過能量轉移（EnT）催化可實現各種光化學轉化，其作用機制如下（圖1B）：首先，三重態光敏劑在光激發下由基態（S0）躍遷至單重激發態（S1），後者通過系間竄越（ISC）轉化至三重激發態（T1）。由於T1→S0的躍遷過程是自旋禁阻的，因此T1相對於S1具有更長的壽命。隨後，通過能量轉移將光敏劑從T1態返回S0，同時將底物由S0激發至具有高反應性的T1態，後者可進行各種分子內/分子間反應。另一方面，化學家通過將非手性光敏劑和非光敏性手性催化劑相結合（圖1C）或者直接使用手性光敏劑（圖1D），成功地開發了一系列不對稱光化學反應，但是這些反應通常對氧敏感，同時需要較高的催化劑負載量並且底物範圍局限。相比之下，酶催化劑具有難以企及的高催化活性，而且通過定向進化還可以改造這些活性位點以最大限度地提高蛋白、底物和光敏劑之間的相互作用，從而得到高效、高選擇性的光催化劑（圖1E）。儘管目前已報道了少數天然光酶和工程酶，但介導對映選擇性EnT過程的酶卻尚未見諸報道。
圖1. [2+2]-環加成的光化學。圖片來源：Nature
Anthony P. Green教授研究團隊以Diels-Alderase DA_20_00為主體骨架，將基因編碼的光敏劑安裝到DA_20_00的β-螺旋槳框架中，從而將Diels-Alderase轉化為用於[2+2]環加成反應的光酶催化劑（EnT1.0）。基於定向進化，該團隊隨後開發了一種高效且高對映選擇性的酶催化劑（EnT1.3，TON>300，高達99% e.e.），可促進分子內和雙分子環加成反應，甚至還能實現小分子催化劑難以進行的轉化，並且可以在有氧條件和室溫下有效運行。
首先，該團隊選擇喹諾酮1為分子內[2+2]-環加成反應的模型底物、二苯甲酮（BP）為光敏劑（圖2B、2C），在光照條件下進行反應時得到了外消旋直鏈產物1a和交叉鏈產物1b的混合物（兩者比為1.4：1）。引入注意的是，將4-苯甲酰基苯基丙氨酸（BpA）作為光敏劑通過基因工程引入DA_20_00疏水空腔內的173位，就可以得到第一代活性光酶EnT1.0（圖2A），其催化活性和選擇性均優於BP，產物1a和1b的比例提高到2：1，同時主產物(-)-1a的e.e.值達到46%。
圖2. 第一代光酶EnT1.0的開發。圖片來源：Nature
為了提高 EnT1.0 的催化活性，該團隊將 BpA173附近的 8個殘基突變為丙氨酸。其中M90A突變使得催化活性大幅提升（1a的產率增加3倍），同時e.e.值提升到60%（光酶EnT1.1）。隨後，該團隊進行了定向進化和高通量篩選，成功地發現了光酶EnT1.3，其活性、穩定性和選擇性都顯著提高（圖3B），其中轉化率提高了10倍、選擇性提高至9：1，同時主產物(-)-1a的e.e.值超過99%（圖3C、圖3D）。有趣的是，EnT1.3在4 °C下比室溫下的催化活性更高，這可能是由於低溫能提高光敏劑三重態的壽命所致。另外，相比於三重態易被氧氣淬滅而失活的小分子光敏劑，EnT1.3則可以耐受有氧緩衝液（圖3D），並具有較高的TON值（>300）。事實上，僅使用1.5 mol% EnT1.3，1就能在2 h內幾乎完全轉化為光學純的(-)-1a，這進一步凸顯出該光酶的優異催化效率。
圖3. 高效和對映選擇性光酶的定向進化。圖片來源：Nature
隨後，該團隊考察了EnT1.3催化不對稱[2+2]-環加成反應的底物範圍（圖4），結果顯示大多數底物都能以良好的轉化率和選擇性得到相應的環加成產物（2a-13a），儘管含有偕二甲基的底物（3、8和12）會導致對映選擇性降低，這可能是由於EnT1.3的活性位點和底物1之間具有高度的形狀互補性。事實上，進化程度較低的EnT1.2能提高3和12的轉化率和選擇性，而EnT1.1 A229S Y37L則能有效地催化底物8。對於N-甲基喹諾酮底物13而言，EnT1.3催化的反應得到了13a（2:1 r.r.，36% e.e.）及其區域異構體13b的混合物。為此，該團隊向EnT1.3中引入Y121F突變並通過定向進化確定了S271C取代，最終以8:1 r.r.和98% e.e.值獲得產物13a，這表明光酶的催化能力可以通過調控蛋白質的活性位點得到改善，並能實現一些現有小分子光催化劑難以進行的選擇性轉化。最後，該團隊還探索了EnT1.3在2-喹諾酮和甲基乙烯基酮/乙基乙烯基酮的分子間[2+2]-環加成反應中的應用，分別以97% e.e.值得到光學純產物14和15。
圖4. 底物範圍。圖片來源：Nature
為了深入了解 EnT1.3 的催化機制，該團隊解析了產物(-)-1a與C-末端截短類似物（EnT1.3ΔC310-314）的晶體結構（圖5），結果顯示Trp244可能在控制反應選擇性上發揮着重要作用，其通過構建活性位點空腔來抑制環外烯烴加成到激發態喹諾酮的對映異位面，從而有利於(-)-1a的生成；而W244A突變則會導致催化活性顯著降低並形成大量外消旋產物。
圖5. (-)-1a與EnT1.3ΔC310-314的配合物晶體結構。圖片來源：Nature
華中科技大學鍾芳銳教授、吳鈺周教授團隊和西北大學陳希教授團隊選擇多藥耐藥調節因子LmrR作為光酶開發的蛋白質框架，這種蛋白質在其二聚體界面處具有一個大的疏水結合口袋。該團隊將二苯甲酮類三重態光敏劑（能夠對映誘導激發態）通過基因密碼子拓展技術定點插入到LmrR蛋白的手性空腔中，構建了含非天然催化活性中心的人工光酶TPe。經過四輪定向進化，該團隊獲得了結構優化的光酶TPe4.0，能夠實現吲哚衍生物的對映選擇性分子內[2+2]光環加成反應（圖6c），並且具有良好的底物適用性和優異的對映選擇性（高達99% e.e.）。
圖6. 對映選擇性[2+2]環加成三重態光酶（TPe）的設計。圖片來源：Nature
該團隊選擇吲哚衍生物1a的分子內[2+2]光環加成為模型反應（圖7a），當使用二苯甲酮為光敏劑時，能以91%的產率得到所需產物2a（圖7d）。隨後，該團隊將二苯甲酮類光敏劑通過基因密碼子拓展技術定點插入到選定蛋白的手性空腔中，構建了含非天然催化活性中心的人工光酶TPe（圖7b、7c），在經過三輪定向進化後，該團隊發現TPe3.0（5 mol%）在4 ℃下能以85%的產率和90%的e.e.值獲得產物2a，但是TPe3.0具有明顯的底物特異性，吲哚環上帶有取代基的底物（2h、2m、2n）的對映選擇性較差。為此，該團隊通過TPe3.0-1b複合物的晶體結構來探究底物和光酶之間的相互作用，發現立體化學可能源於光敏劑和氨基酸殘基與底物之間的非共價相互作用。然後，該團隊對TPe3.0進行優化，並獲得了優異的突變體TPe4.0_FbpA（產率：93%，e.e.值：91%）。
圖7. TPe的定向進化。圖片來源：Nature
隨後，該團隊評估了三重態光酶催化的底物範圍（圖8），結果顯示C2位（2a-2f）或者苯環上（2h-2n）帶有不同基團的吲哚衍生物均能高效地實現分子內[2+2]光環加成反應，以優異的產率和對映選擇性得到所需產物，特別是產物2a、2b、2m還能進行10 mg級規模合成。另外，含偕二甲基的吲哚衍生物1o也能以80%的產率和93%的e.e.值得到產物2o，後者含有4個相鄰的季碳中心。需要指出的是，在某些情況下還可以通過直接光激發（採用弱光強或長波長照射）來減弱競爭性背景反應（2e-h、2n-o）。對於e.e.值<90%的底物（2h、2g、2j、2k、2n），該團隊進一步優化了酶結構，例如：TPe3.0_FBpA_L96V更適合底物1j和1k；而TPe4.0_FBpA_V99C能將5-氟吲哚產物2n的對映選擇性提高至91%。有趣的是，TPe4.0_FBpA還能實現其它類型N-Boc吲哚底物（如：吲哚-2-羧酸衍生物1p）的光環加成反應（產率：92%，e.e.值：57%）。
圖8. 底物範圍。圖片來源：Nature
以上兩項研究「英雄所見略同」，將光催化劑與蛋白質結合帶來新的反應模式，從根本上擴大了酶催化的應用範圍。可以預見，三重態光酶有望成為多種有價值對映選擇性光化學轉化的通用解決方案。
1. 原文（掃描或長按二維碼，識別後直達原文頁面）：
A Designed Photoenzyme for Enantioselective [2+2]-Cycloadditions
Jonathan S. Trimble, Rebecca Crawshaw, Florence J. Hardy, Colin W. Levy, Murray J. B. Brown, Douglas E. Fuerst, Derren J. Heyes, Richard Obexer, Anthony P. Green
Nature, 2022, DOI: 10.1038/s41586-022-05335-3
2. 原文（掃描或長按二維碼，識別後直達原文頁面）：
Enantioselective [2+2]-cycloadditions with triplet photoenzymes
Ningning Sun, Jianjian Huang, Junyi Qian, Taiping Zhou, Juan Guo, Langyu Tang, Wentao Zhang, Yaming Deng, Weining Zhao, Guojiao Wu, Rongzhen Liao, Xi Chen, Fangrui Zhong, Yuzhou Wu
Nature. 2022, DOI: 10.1038/s41586-022-05342-4
參考資料：
華中科技大學報道：
http://chem.hust.edu.cn/info/1052/9993.htm
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