近年來，二代測序（next-generation sequ enc ing，NGS）被越來越廣泛地用於指導腫瘤的精準治療，並加速了靶向治療和免疫治療的臨床研究入組效率，已陸續獲批成為特定抗腫瘤藥物的伴隨診斷。根據2021年國家藥品監督管理局藥品審評中心發布的《生物標誌物在抗腫瘤藥物臨床研發中應用的技術指導原則（徵求意見稿）》，依照功能特點的不同，可將與藥物研發相關的生物標誌物分為診斷性、預後性、預測性、藥效學、安全性和監測性六類。已有大量臨床研究證據表明，基於NGS的生物標誌物檢測在診斷、預後、預測和動態監測等方面具有重要指導價值。與傳統的基因檢測方式相比，NGS具有明顯的技術優勢，例如可以覆蓋各種變異形式，用於血液樣本檢測等。生物標誌物需要經過嚴謹的研究設計和前瞻性臨床驗證，方可用於指導臨床診療活動，探索和驗證能夠用於指導臨床治療決策的標誌物在臨床研究中扮演越來越重要的角色。
1 二代測序技術指導腫瘤精準治療的現狀和挑戰
1.1 NGS技術用於臨床診療活動的優勢
Khodakov等將基因變異檢測技術分為聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、雜交和測序三大類（表1）。NGS是一種基於DNA和RNA的大規模多重序列分析的方法，其檢測通量和單鹼基成本優於Sanger測序。與PCR和以熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）為代表的雜交技術相比，NGS尤其適用於高通量並行分析和未知變異檢測，能夠充分利用有限的樣本完成多個標誌物檢測，還可用於血液樣本分析以及耐藥機制的探索。根據NGS檢測分析腫瘤驅動基因變異或潛在治療靶點能夠指導臨床治療並為患者帶來確實可靠的生存獲益。
1.2 NGS在臨床腫瘤診斷中的需求與挑戰
《二代測序技術在腫瘤精準醫學診斷中的應用專家共識》提出NGS技術在臨床實踐過程中存在包括檢測技術、數據管理、分析與報告、解讀與臨床諮詢等方面的各種挑戰。在臨床實踐中各實驗室NGS平台的檢測方法、質控流程、判讀標準等方面尚不統一，導致不同實驗室的檢測質量參差不齊，結果之間缺乏可比性。目前國內外針對NGS檢測的室間質評體系已經逐步建立起來，未來隨着腫瘤分子標誌物的研究進展及檢測技術的優化，所對應的室間質評體系也需要進行迭代。
2 基於二代測序的腫瘤伴隨診斷
2.1 美國食品藥品監督管理局批准的基於NGS的實體瘤伴隨診斷
截至目前，美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的實體瘤NGS伴隨診斷產品主要有8種，包括Foundation One CDx/F1CDx、Foundation Focus CDx BRCA、Foundation One Liquid CDx、Guardant 360
CDx、Praxis Extended RAS Panel、Oncomine Dx Target Test、Myriad my Choice CDx和ONCO/Reveal Dx Lung & Colon Cancer Assay。除Foundation One Liquid CDx和Guardant 360 CDx用於檢測血漿標本外，其他產品均用於檢測石蠟包埋的腫瘤組織樣本。
本文以組織檢測代表Foundation One CDx/F1CDx和血漿檢測代表Guardant 360 CDx為例綜述近年來相關實體瘤研究，其他檢測方法見表2。
2.1.1 Foundation One CDx/F1CDx（Foundation Medicine, lnc）
F1CDx主要用於檢測石蠟包埋的腫瘤組織樣本中EGFR、
ALK、BRAFV600E、MET等基因變異，已被美國FDA批准用於多種實體瘤臨床治療的伴隨診斷。Wang等採用F1CDx檢測了23例早期復發的三陰性乳腺癌患者腫瘤組織中基因變異情況，結果發現檢出的高頻突變包括TP53（83%）、PTEN（35%）、RB1（30%）、PIK3CA（26%）和BRCA1（22%），其中1例ERBB2擴增以及另外1例ERBB2外顯子20插入的患者其免疫組織化學檢測結果均為陰性，另外還檢出1例在乳腺癌中未被報道的ROS1-EPHA7融合。Garcia-Pardo等開展了一項多中心回顧性研究，納入15個中心接受NGS檢測（Foundation One）的晚期膽管癌患者，結果發現12例（40%）患者攜帶可指導治療的分子標誌物，包括FGFR2融合（2例）、IDH1突變（6例）、ERBB2突變（1例）、ROS1融合（1例）、PIK3CA突變（1例）和微衛星高度不穩定（microsatellite instability-high，MSI-H）（1例）。F1CDx還可通過324個基因的變異檢出情況評估腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB），用於篩選接受帕博利珠單抗治療不可切除或轉移性腫瘤高TMB（TMB-H，TMB ≥ 10 muts/Mb）的患者。基於3項多中心、開放標籤、單臂臨床試驗的數據[LOXO-TRK-14001（NCT02122913）、SCOUT（NCT02637687）和NAVIGATE（NCT02576431）]，F1CDx被批准用於識別適用larotrectinib治療的NTRK基因融合實體瘤患者。
2.1.2 Guardant 360 CDx
Guardant 360 CDx結合了NGS和液體活檢技術，其panel覆蓋74個基因，可用於檢測識別美國國家綜合癌症網絡（National Comp-rehensive Cancer Network，NCCN）非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）指南推薦的7種生物標誌物（EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、MET、NTRK）。截至目前，Guardant 360 CDx被美國FDA批准用於鑑定EGFR、MET、KRAS變異，攜帶這些變異的患者分別可從奧希替尼、amiv anta-mab、sotorasib治療中獲益。Leighl等採用Guar-dant 360 CDx檢測了來自轉移性NSCLC患者60例組織標本和77例血液標本，美國FDA獲批靶點的組織和血液檢出一致性＞ 98.2%，以組織為對照cf DNA陽性預測值達到100%，提示血液與組織一致性較高。
此外，採用NGS技術監測循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ct DNA）動態變化並評估平均突變頻率，發現影像學應答的患者其分子應答值顯著降低，分子應答陽性的接受帕博利珠單抗單藥或聯合化療的NSCLC患者無進展生存（progr-es sion-free survival，PFS）時間和總生存（overall sur vi val，OS）時間均顯著延長。
2.2 NCCN、中國臨床腫瘤學會和歐洲腫瘤內科學會指南對
NGS臨床應用的指導意見
基於NGS的基因檢測作為一種重要的工具已被納入多個瘤種的指南。如NCCN明確指出，對於晚期或轉移性NSCLC患者應進行NGS檢測驅動基因變異情況，主要包括EGFR敏感突變、ALK重排、ROS1重排、BRAFV600E突變、NTRK融合、METex14跳躍和RET重排。除以上驅動基因外，NCCN強烈建議檢測更廣泛的分子變異，識別可能存在有效藥物的罕見變異或臨床試驗的陽性標誌物，為患者提供參考建議。NGS在胃癌患者中的重要性也得到了進一步提升，NCCN提出在微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）/錯配修復（mismatch repair，MMR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和程序性死亡蛋白配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）表達檢測完成後，剩餘組織樣本可以考慮進行NGS檢測。而在組織樣本有限的情況下，可以直接進行NGS檢測以發現多種基因變異。在轉移性或晚期胃癌患者無法進行組織活檢的前提下，可由美國臨床實驗室改進法案修正案（Clinical Laboratory Improvement Amendments，CLIA）認證的實驗室中採用預先驗證的NGS panel對血液樣本進行液體活檢。
根據中國臨床腫瘤學會（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）制定的NSCLC診療指南，對於不可手術的Ⅲ期和Ⅳ期患者應基於分子分型指導臨床治療（Ⅰ類證據）。非鱗狀NSCLC患者進行EGFR突變、ALK融合以及ROS1融合檢測（Ⅰ類推薦）。在標本量有限的情況下，可採用同時檢測多個驅動基因的技術，如PCR技術或NGS技術。在無法獲取足量的腫瘤組織條件下，外周血游離DNA可代替組織樣本行EGFR突變檢測。EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）耐藥患者建議再次進行活檢明確T790M突變狀態。2021年CSCO胃癌診療指南的分子分型指導治療中，對於標準治療失敗的胃癌患者推薦採用NGS檢測NTRK融合情況。歐洲腫瘤內科學會（European Society of Medical Oncology，ESMO）建議在晚期非鱗狀NSCLC、前列腺癌、卵巢癌和膽管癌的腫瘤樣本中常規使用多基因NGS檢測。在肺腺癌臨床診療過程中建議採用腫瘤多基因NGS評估Ⅰ級變異，即可用於臨床常規治療決策的靶點。EGFR突變是晚期非鱗狀NSCLC發現的第1個驅動基因，其大多為外顯子19缺失和L858R熱點激活突變，以及T790M獲得性耐藥突變，屬於ⅠA類證據。此外，ALK融合、METex14跳躍、BRAFV600E突變、ROS1融合、NTRK融合、RET融合均為Ⅰ類證據。在前列腺癌患者可以使用多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP ribose）polymerase，PARP]抑制劑的國家和地區，建議對腫瘤樣本進行NGS檢測且至少評估BRCA1/2的突變狀態，如使用大panel應當包括DNA修復相關基因和MSI。ESCTA分類下Ⅰ類證據包括BRCA1/2突變或缺失和MSI-H。在卵巢癌中，BRCA1/2體細胞突變與PARP抑制劑獲益相關，推薦多基因NGS也是合理的。腫瘤多基因NGS可用於檢測膽管癌Ⅰ級可採取治療措施的突變，包括IDH1突變、FGFR2融合、MSI-H、NTRK融合。在不增加公共衛生保健系統的額外費用以及告知患者受益可能性較低的情況下，患者和醫生可以共同決定是否使用大基因組合（panel）。
2.3 基於NGS的傘式研究和籃子研究
國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心發布的《與抗腫瘤藥物同步研發的原研伴隨診斷試劑臨床試驗註冊審查指導原則（徵求意見稿）》指出，特殊情況下可進行新型研究設計，諸如籃式設計、傘式設計等。傘式研究能夠識別同一類腫瘤患者特定位點突變或基因擴增的多個不同亞組。籃子研究則與腫瘤類型無關，它對攜帶同一基因變異的患者進行相同的靶向治療。相關研究提供了兩種可能性，即基於生物標誌物的現有藥物療效評價或靶向基因變異研發新型藥物將NGS納入臨床試驗和新藥研發已經取得了實質性進展。Jiang等開展了一項基於基因標誌物的ⅠB/Ⅱ期傘式臨床研究FUURE（NCT03805399），該項目成功驗證了複雜分型指導下精準治療的有效性，將難治性轉移三陰性乳腺癌客觀緩解率（objective response rate，ORR）提高至29.0%（95%CI ：
18.7% ～ 41.2%），最高ORR為免疫治療臂的52.6%（95%CI ：28.9% ～ 75.6%），證明了基於分子亞型精準治療的臨床獲益。Hyman等開展了一項BRAFV600E突變的非黑色素瘤Ⅱ期籃子研究，納入了接受維莫非尼治療的NSCLC、膽管癌、乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌等瘤種共122例患者。結果提示NSCLC的有效率為42%，大部分患者均出現不同程度的腫瘤縮小（14/19），中位PFS時間為7.3個月，第12個月PFS率達到23%。此外，在其他瘤種中均有治療響應和腫瘤縮小的案例。以上結果提示在精準醫療時代，探索有效的藥物療效預測標誌物和研發針對不同靶點的藥物對於指導臨床治療決策是必不可缺的。
總之，精準醫學臨床試驗的傘式研究和籃子研究能夠最大限度地為患者匹配精準治療，從而改善臨床預後。相關研究設計和臨床應用的難點可能在於跨適應證用藥的有效性缺乏理論依據 ；檢測公司和藥企、藥企和藥企之間合作藥物的可及性問題 ；以及檢測發現多個用藥靶點存在的情況下如何考量用藥的優先級別等。
3 二代測序助力新藥研發和耐藥機制探索
自20世紀50年代以來，獲得上市許可的藥物數量呈持續下降趨勢。目前一種藥物從初始研究到成功上市的概率約為3%。然而具有支持性變異信息的藥物的成功率是無靶點藥物的2倍以上。目前大約50%的上市藥物都有一些支持它們的基因層面證據。2021年美國FDA批准了首個治療EGFR外顯子20插入突變的NSCLC靶向藥物EGFR/MET雙特異性抗體amivantamab，同時獲批的伴隨診斷為Guardant 360 CDx。同年美國FDA亦加速審批了infigratinib用於既往經過治療的、不可手術切除的、攜帶FGFR2基因融合或重排突變的局部晚期或轉移性膽管癌患者，同時獲批的伴隨診斷產品為Foundation One CDx。在局部晚期或轉移性泛實體瘤中，美國FDA批准了首個基於腫瘤變異特徵即NTRK融合的廣譜靶向藥物larotrectinib。Doebele等納入了恩曲替尼的3項Ⅰ/Ⅱ期研究（ALKA-372-001、STARTRK-1和STARTRK-2），包括54例晚期NTRK融合陽性的10個瘤種19個不同的組織病理類型。整體人群的ORR達到57%（31/54），其中7%的患者達到完全緩解，50%的患者達到部分緩解。以上數據提示NGS檢測NTRK融合能夠拓寬泛實體瘤患者的治療選擇。
Hong等開展了一項名為Code Break 100的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，結果發現攜帶KRASG12C突變局部晚期或轉移性NSCLC患者能從sotorasib治療中獲益，基於NGS檢測的KRASG12C突變能夠準確識別該類患者。Zhang等採用NGS研究了中國首個原研三代EGFR-TKI avitinib耐藥的基因譜，結果發現接受avitinib治療後進展的患者耐藥譜呈現明顯的異質性，其中15%（4/27）的患者出現EGFR T790M丟失，13%（4/30）的患者發生包括C797S在內的EGFR三級突變，37%（11例）的患者出現EGFR擴增。其他的耐藥突變包括CDKN2A、MET、PIK3CA、HER2、TP53和RB1，此外還發現了小細胞肺癌轉化的現象。
4 循環腫瘤DNA
動態監測優化晚期腫瘤的療效評估我國首個肺癌微小病灶殘留（minimal residual disease，MRD）的檢測和臨床應用共識提出，目前晚期NSCLC缺乏針對MRD的相關研究，晚期NSCLC系統性治療完全緩解後建議檢測MRD，有助於判斷預後和制訂進一步的治療策略。國外現有相關研究主要聚焦在ct DNA以及治療前後變異等位基因頻率（variant allele fraction，VAF）動態監測用於預測晚期腫瘤治療應答以及患者生存。Thompson等採用74個基因的Guardant360 Response test檢測了接受帕博利珠單抗治療的晚期NSCLC患者的ct DNA狀態，結果發現76.1%（51/67）的患者檢測到1個及以上的基因變異（VAF ≥ 0.3%）。將治療前後平均VAF的比值下降超過50%定義為分子應答，發生分子應答的患者PFS時間和OS時間均顯著延長，提示採用ct DNA進行分子應答評估可以作為一種非侵入性的預測帕博利珠單抗療效的指標。Zhang等分析了來自於3項Ⅰ/Ⅱ期度伐利尤單抗臨床試驗的16種晚期實體瘤治療前（978例）和治療後（171例）的ct DNA狀態，結果提示治療前ct DNA水平與患者預後相關。評估治療前後ct DNA VAF水平變化能夠鑑定出治療獲益人群。在初次評效為疾病穩定的患者中，ct DNA動態變化可以提前判斷患者對治療的應答情況。Raja等也得到了類似的結果，他們發現在轉移性NSCLC和尿路上皮癌中，ct DNA VAF水平變化與治療療程、抗腫瘤活性和患者預後均顯著相關。Kim等發現在61例接受帕博利珠單抗治療的轉移性胃癌患者中，治療後第6周ct DNA水平能夠預測患者療效和PFS時間，ct DNA水平降低提示患者預後較好。目前ct DNA檢測尚處於探索階段，需要前瞻性研究確定其靈敏度、特異度、穩定性和預測價值。近年來研究發現ct DNA檢出腫瘤復發的時間明顯早於影像學，在監測治療效果的同時能夠識別出需要提前干預的患者。Magbanua等發現ct DNA與影像學聯用能夠預測乳腺癌患者新輔助治療療效和復發風險，未來ct DNA單獨或聯合影像學指導臨床治療決策也將得到更多關注。未來需要開展干預性研究進一步驗證，根據ct DNA動態變化採取不同的干預方式能否帶來臨床獲益，如根據ct DNA動態監測的結果延長或縮短治療時間，ct DNA動態監測作為臨床研究終點的可行性，分子復發但是影像學未進展時提前給予治療干預等。
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癌症基因組學的發展和應用揭示了不同腫瘤、同一腫瘤不同亞型或同一患者不同腫瘤部位之間普遍存在異質性，利用分子特徵評估或預測特定干預方法的療效將引領精準腫瘤學的未來發展。近年來越來越多的研究發現NGS成為了探索腫瘤生物標誌物和實現個體化精準治療的有力手段。國內需要建立NGS行業標準並在相應法規的指導下規範開展工作。根據國家藥品監督管理局藥品審評中心的指導原則鼓勵在新藥研發過程中進行基於NGS的生物標誌物探索。ct DNA動態監測能夠提供精準的療效評估，未來可能作為臨床研究的重點之一，通過優化療效評估手段進一步助力新藥研發和臨床試驗開展以及患者管理。
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