鑽石舞台

今天給大家分享一篇最新發表的生信高分文章，文章標題：Single-Cell Transcriptomic Analysis Reveals Circadian Rhythm Disruption Associated with Poor Prognosis and Drug-Resistance in Lung Adenocarcinoma.

研究背景

晝夜節律是維持正常細胞和組織平衡的重要調節系統，已被證明在細胞增殖、DNA修復、代謝和炎症等癌症相關的過程中發揮關鍵作用。晝夜節律紊亂(CRD)是腫瘤增殖的主要因素。然而，CRD在臨床預測癌症預後中的作用還沒有得到很好的研究。

研究思路

研究結果

1.晝夜節律紊亂(CRD)狀態下的惡性細胞與肺腺癌腫瘤相關

作者將GEO數據庫中兩個肺腺癌患者單細胞數據集進行樣本合併，得到原發灶(n=17)和遠處轉移灶(n=10)，以及接受了新輔助化療的患者(n=3)的scRNA數據。經過質量控制篩選，從三種患者樣本中共獲得96,024個細胞進行下游分析。首先根據細胞標記基因進行細胞群鑑定（免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞和上皮細胞），然後根據染色體拷貝數變異，從上皮細胞鑑定出惡性細胞群。細胞群占比分析結果顯示，惡性細胞的數量隨着癌症分期的進展而增加，而且惡性細胞cluster具有顯著的患者間異質性。

接下來，利用來自惡性細胞的2,091個晝夜節律基因的表達譜進行WGCNA分析。選擇與樣本來源和TNM分期正相關的具有358個CRG的基因模塊，功能富集分析發現這些基因在晝夜節律相關的信號通路中富集。然後作者開發了一種評分算法來量化惡性細胞中的CRDscore。結果發現與其他類型的細胞相比，惡性細胞表現出較高的CRDscore，即相對嚴重的CRD。而且晚期LUAD由更多CRDscore值高的惡性細胞組成。根據CRDscore將惡性細胞分為兩組(高與低)。功能富集分析發現糖酵解、G2M檢查點和MYC靶途徑在CRDhigh組顯著富集。這些結果表明，CRD可能促進腫瘤的進展。

2.CRD對TKI的療效影響

為了探究CRD是否能影響TKI治療的療效，作者對一個從22名接受TKIs的患者樣本單細胞數據集進行分析，樣本分為三組：靶向治療前（TN），治療應答（RD），和治療無應答（PD）。首先還是細胞群分類以及惡性細胞群鑑定，然後比較TKI組之間的細胞亞群分布，發現惡性細胞具有高度的TKI特異性，主要富集於PD樣本中。

為了評估CRD對TKI治療的影響，作者根據358個晝夜節律基因表達譜計算了惡性細胞的CRDscore,發現CRD高的惡性細胞主要來自於PD樣本。同樣，轉移性和晚期患者的CRDscore也較高。然後將患者按CRDscore分為兩組（高與低）。CRDhigh患者的總體TKI反應率明顯低於CRDlow患者。這些結果意味着，CRDhigh與TKI的結果有關。 我們進一步根據CRD狀態和TKIs結果（應答與無應答）進行基因功能分析，結果發現，糖酵解、氧化磷酸化（OXPHOS）和自噬途徑在PD和TN患者的CRDhigh中同時富集。 此外還發現，糖酵解和細胞衰老信號的激活在應答與無應答組間有明顯差異。葡萄糖和脂質代謝相關基因如GPI、IDH1和DLD在CRDhigh患者的惡性細胞中高表達，G6PD、HK2、ALOX5和DGKA的表達水平與CRDscore呈正相關。因此推測，CRD和代謝可能影響了惡性細胞的耐藥狀態。

3.CRD重塑了腫瘤微環境的細胞間相互作用和細胞因子信號傳導

使用CellPhoneDB進行細胞通訊分析，發現來自惡性細胞的趨化因子的總體表達水平被CRD改變。此外，CRDhigh顯著抑制惡性細胞產生的共刺激信號，而共抑制細胞因子如LGALS9、FAM3C和CD47在CRDhigh細胞中顯著升高。由於HAVCR2、PDCD1和SIRPG在耗盡的CD8+ T細胞中特異性表達，惡性細胞分泌的共抑制性細胞因子可能是T細胞減少和耗盡的原因。結果還表明CRD下的M1和M2巨噬細胞顯示了對T細胞的共抑制和共刺激信號的不同效應。值得注意的是，惡性細胞和巨噬細胞協同作用，CRDhigh激活Th2和Treg細胞。鑑於細胞因子在癌症進展中對細胞間通訊至關重要，作者研究了CRD是否在單細胞水平上調節細胞因子信號傳導活性。發現CRDhigh惡性細胞中激活的36種細胞因子相關通路，這些細胞因子通路的活性水平與來自T細胞和/或巨噬細胞的標記正相關。總的來說，CRD的多樣性表明了腫瘤微環境(TME)組成的差異。

4.Bulk RNA數據集驗證CRDscore的性能和穩健性

接下來，作者收集了bulk RNA數據集探究CRD對腫瘤的影響。首先，基於暴露於晝夜節律去調節治療(CDT)或未暴露的小鼠模型的bulk RNA數據發現，CDT的樣本的CRDscore高於正常對照樣本，並且CDT組與糖酵解、低氧和免疫反應等信號通路特徵相關。這些結果表明，基於晝夜節律基因特徵的CRDscore算法可以有效地定義bulk RNA數據集中的CRD狀態。

然後作者使用來自TCGA數據庫的LUAD樣本來評估CRD水平和免疫浸潤，發現CRDlow的樣本的免疫評分和間質評分顯著高於CRDhigh的樣本。另一方面，腫瘤純度在CRDhigh樣本中明顯較高。值得注意的是，CRDscore與浸潤的Treg和Th2細胞的豐度呈正相關，單細胞分析證實了這一點。同時，普遍上調的抗原提呈和共刺激在CRDlow樣本中觀察到免疫調節作用，而在CRDhigh樣本中PD-L1、LAG3和HIF-α的表達水平較高。C-MYC靶點、缺氧、EMT和糖酵解途徑被確定為腫瘤細胞增殖和侵襲的標誌，並在CRDhigh樣本中富集。總之，CRD可以調節促腫瘤微環境的重建，進一步支持在單細胞水平上的分析結果。

5.CRD與多種癌症類型的預後不良有關

由於CRD與促腫瘤微環境的重塑密切相關，作者隨後對CRDscore是否能準確預測臨床結果進行探究。首先，作者通過5個獨立數據集分析了CRDscore的預後價值。單因素COX回歸分析表明CRDscore是與總生存期(OS)相關的有統計學意義的臨床因素。為了評估CRDscore的預後價值，通過生存分析比較了不同CRD評分組(高與低)的OS。在LUAD數據集中，CRDhigh患者的OS顯著低於CRDlow患者，表明CRDscore是LUAD的一個有價值的預後指標。此外，作者分析了來自TCGA的22種癌症類型的7500多個樣本，包括乳腺癌和前列腺癌，結果發現腫瘤組織的CRDscore明顯高於鄰近正常組織。然後，根據中位數將患者分為CRDhigh分組和CRDlow分組。在肺腺癌、胰腺癌、間皮瘤和葡萄膜黑色素瘤四種癌症類型中，CRDhigh的患者在單因素和多因素生存模型中的預後均較差。這些結果表明，CRD狀態在多種癌症類型中均具有潛在預後分類能力。

6.探究CRD對腫瘤治療療效的預測能力

接下來，作者檢驗了CRDscore在兩個獨立的接受化療的LUAD隊列中預測療效的能力。結果發現，CRDlow患者的治療效果明顯更好，他們的5年生存率是CRDhigh的兩倍多。值得注意的是，與scRNA-seq分析的結果一致，CRDscore可以作為評估非小細胞肺癌TKI治療反應的有價值的工具。然後，作者還通過預測乳腺癌患者對化療的反應來評估CRDscore的預測性能。與NSCLC隊列的結果一致，CRDscore在接受化療的乳腺癌數據集中預測能力表現良好。

為了探索晝夜節律基因譜是否可以作為免疫治療的指標，基於358個CRG表達譜，使用LASSO和SVM-RFE算法同時識別了包括23個CRG的基因集。接下來，構建了一個廣義線性回歸模型(CRGm)來預測14個獨立癌症隊列的免疫治療反應，包括接受免疫治療的非小細胞肺癌、黑色素瘤和膀胱尿路上皮癌患者。在沒有進一步訓練的情況下，所有隊列中CRGm應答(RD)樣本的預測指數都高於無應答(NR/PD)樣本。此外，將CRGm與其他已發表的基於mRNA表達的免疫治療反應預測指標進行了比較，如T細胞炎症基因表達譜(GEP)和PD-L174的表達。結果發現CRGm的整體性能比其他預測指標更穩健和準確。重要的是，CRGm中與晝夜節律相關的基因，包括CLOCK、GIMAP5和ICOS，在T細胞分化和激活中起着關鍵作用，可以從生物學上支持預測模型的意義。

7.實驗驗證褪黑素可減弱CRD和癌細胞的侵襲性

最後，作者通過體外功能實驗來驗證生信分析結果。利用兩個非小細胞肺癌細胞系(A549和H1299)和一個人支氣管上皮細胞系BEAS-2B，首先通過RT-qPCR檢測了核心晝夜節律基因表達的變化。發現在癌細胞中的CLOCK表達顯著高於對照細胞。同樣，免疫組化實驗也表明，HPA上調了腫瘤組織中CLOCK的表達，免疫熒光進一步證實CLOCK蛋白主要在癌細胞的胞漿和細胞核表達。

此外，為了更好地理解CRD作為癌症的一個特徵，作者還研究了針對晝夜節律的治療方法對H1299細胞表型的影響。為此，作者首先檢測癌細胞的侵襲性，在使用siRNA或褪黑素預處理敲除CLOCK後，細胞顯示出侵襲性受損。隨後，通過RNA測序篩選各組間的差異表達基因(DEGs)。DEGs的功能富集分析發現褪黑素處理的細胞顯著富集的通路與晝夜節律、能量動態平衡和對氧化應激的反應等相關。進一步分析發現CRDscore與EMT標記之一SNAIL的轉錄水平呈正相關。值得關注的是，褪黑素可以明顯抑制CRDscore和SNAIL的蛋白水平，這基於褪黑素處理的抗CRD治療可以削弱CRD狀態以及癌細胞的侵襲能力。

小編有話說

小編以為，這篇文章的亮點總結為：分析數據多，分析內容全（生信文章就是這樣捲起來的）。

（1）分析數據多：文章中用到的數據包括單細胞數據，患者bulk RNA數據，小鼠模型bulk RNA數據，以及自測的細胞系bulk RNA數據，不同類型的數據分析結果相互佐證，使得文章結果更可靠；

（2）分析內容全：文章中用到的公共數據，除了樣本量大，還有一個特點，就是數據包含的患者樣本類型非常豐富，包括早期/晚期患者，原發/轉移患者，靶向治療/化療/免疫治療響應與否患者。這就使得文章能夠探究的臨床問題（預後，轉移，治療響應等）非常多，進而使得文章的研究立意豐富飽滿。總之，是一篇不計分析工作量的生信好文！