鑽石舞台

本周我們小張聊科研公眾號推出第六期專題：腫瘤藥物敏感性。今天給大家帶來這期專題的第一篇！

2021年6月24日，來自美國俄勒岡健康與科學大學奈特癌症研究所的研究者人員，在CancerCell（IF=31.743）上發表了題為The AML microenvironment catalyzes a stepwiseevolution to gilteritinib resistance的研究性文章，使用多種研究手段，詳細介紹了FLT3突變的急性髓系白血病 (AML) 中gilteritinib耐藥性的逐步演變，確定AURKB對早期抗性至關重要。

一、研究背景

急性髓性白血病(AML) 是一種侵襲性血液系統惡性腫瘤，其特徵是未成熟成髓細胞的異常增殖，浸潤骨髓並破壞正常的造血功能。fms相關受體酪氨酸激酶3 (FLT3) 基因的驅動突變是AML中最常見的一種，30%的患者發生此現象。gilteritinib是一種口服的強效、選擇性FLT3抑制劑。然而，殘留細胞會在骨髓微環境中存活。隨着時間的推移，這些早期耐藥細胞進化出內在耐藥機制，導致AML復發。

二、研究方法

本研究中，通過整合全外顯子組測序(WES)、CRISPR-Cas9 篩選、代謝組學、蛋白質組學、磷酸蛋白質組學和小分子抑制劑篩選（匯集了當前最火的研究手段，「燒錢」666啊），全面分析了早期到晚期gilteritinib耐藥性的時間演變。

三、研究結果

1）現象：微環境因素促進早期gilteritinib耐藥的發展

為了模擬gilteritinib耐藥中的微環境保護，研究者使用了外源性成纖維細胞生長因子2 (FGF2) 和FLT3配體 (FL)，以保護細胞避免受多個FLT3抑制子影響。結果顯示gilteritinib處理的MOLM14細胞未恢復生長，然而所有補充了FGF2或FL的培養物最終都恢復了生長。這些結果突出了外在生存因素在促進對gilteritinib的早期耐藥性方面的重要性。

2）基因變化：在晚期耐藥而非早期耐藥中，NRAS突變占主導地位

研究者對晚期gilteritinib耐藥的MOLM14 和 MV4；11 培養物進行了WES分析，並在13/15個培養物中發現了激活的NRAS點突變。隨後評估了這些突變在長期培養過程中出現的時間。通過Sanger測序，在MOLM14培養物中配體存在4個月時，無法檢測到突變。這些結果說明NRAS突變在晚期而非早期耐藥中富集。

3）全基因組CRISPR-Cas9篩選：顯示早期抗性比晚期抗性更複雜

為了從基因上尋找驅動抗性的信號通路，研究者在具有代表性的FGF2和FL早期和晚期抗性MOLM14培養物中進行了全基因組CRISPR-Cas9再敏化篩選。FGF2-和FL-依賴性培養物的CRISPR-Cas9分析沒有確定導致早期gilteritinib耐藥的單個基因，而是揭示了許多參與細胞周期進程、脂質代謝和PI3K/MAPK信號通路的基因。與早期抗性相比，NRAS是迄今為止晚期抗性培養物中最顯著的分子。以上結果表明，早期gilteritinib耐藥是多因素的，而晚期耐藥則表現出對NRAS的依賴性。

4）代謝組學：早期和晚期gilteritinib耐藥細胞表現出獨特的代謝依賴性

FGF2和FL早期CRISPR-Cas9篩選出來的多種分子表明，代謝波動可能有助於早期耐藥。因此，通過對早期和晚期gilteritinib耐藥培養物中代謝物的檢測，表明長期FLT3抑制導致廣泛的代謝重編程。偏最小二乘判別分析揭示，相對於親本細胞，早期和晚期gilteritinib耐藥的MOLM14培養物中代謝組學存在顯著差異。這些結果表明代謝重編程從早期抵抗開始，並持續到晚期抵抗。

5）蛋白組學：早期和晚期gilteritinib耐藥培養物具有不同的蛋白質組學特徵

為了進一步確定早期耐藥性，研究者進行了蛋白質組學和磷酸蛋白質組學，分析表明早期和晚期gilteritinib耐藥培養物具有不同的蛋白質組學特徵，早期耐藥顯著降低了細胞周期蛋白的活性。

6）實驗驗證：早期gilteritinib耐藥性依賴AURKB進行細胞周期調節

磷酸化蛋白質組學數據表明細胞周期的改變有助於早期gilteritinib耐藥。因此，研究者通過通過定量分析細胞周期、AURKB抑制劑以及CRISPR-Cas9敲除AURKB實驗方法，發現早期耐藥培養物的細胞周期較慢，AURKB的抑制使早期耐藥MOLM14細胞對gilteritinib重新敏感。

7）臨床轉化：早期和晚期gilteritinib耐藥模型概括了人類疾病

為了評估早期耐藥培養物的臨床相關性，研究者選擇12名接受gilteritinib治療的AML患者，原發性早期耐藥AML樣本的靶向蛋白質組學顯示細胞周期蛋白減少，脂質代謝蛋白增加，MAPK信號蛋白改變；體外治療證實AURKB在早期耐藥性中的脆弱性。

四、總結

本研究詳細介紹了FLT3突變的AML中gilteritinib 耐藥性的逐步演變。

本模型密切反映了接受gilteritinib治療的AML患者的時間和突變。AURKB的藥理學抑制使接受gilteritinib治療的AML患者的早期耐藥細胞培養物和原代白血病細胞重新敏感。這些發現為臨床治療提供了有效策略，即在預先存在的耐藥突變擴大之前，用AURKB抑制劑和gilteritinib靶向早期耐藥AML細胞。（行文至此，各位看官發現了嗎，原來我們走過最深的路，是頂刊的套路啊：現象—機制—臨床轉化是最基本的思路，運用時下最火的研究方法，瞬間讓文章上了好幾個檔次，然而這些都是白花花的銀子呀！So~各位準備發大paper的小夥伴們，準備好「燒錢」了嗎~好啦，我們下次頂刊見bye~）