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背景

N6-甲基腺苷 (m6A)是一種廣泛存在的RNA修飾，在基因表達控制中發揮多種作用，並參與多種生理過程和疾病狀態。因此，識別m6A在不同RNA中和群體的單細胞中的分布對於理解m6A殘基如何促進正常細胞功能和疾病發病機制至關重要。然而，目前的m6A檢測策略需要大量的輸入RNA，因此，迄今為止，所有轉錄組範圍的m6A分析研究都已在包含數千或數百萬細胞的大細胞群中繪製了m6A圖譜。因此，非常需要開發能夠識別單細胞內m6A位點的m6A分析方法。

簡介

2022年1月22日，來自美國杜克大學醫學院的Matthew Tegowski及其團隊在Mol Cell (IF: 15.584)雜誌上發表名為scDART-seq reveals distinct m6A signatures and mRNA methylation heterogeneity in single cells的研究[1]。

研究亮點

1、scDART-seq在數千個單細胞中實現全局m6A剖析。

2、大多數mRNAs在一小部分細胞中被甲基化。

3、RNAs的m6A位點比既往報道的多，但大多數很少發生。

4、m6A的化學計量在種群的個體細胞中是高度可變的。

主要結果

scDART-seq識別單細胞中的m6A位點

為了確定DART-seq是否能定位單細胞中的m6A位點，我們首先建立了表達可誘導APOBEC1-YTH或APOBEC1-YTHmut的HEK293T穩定細胞系，該細胞系缺乏YTH結構域的m6A結合區域，便於在下游分析中去除脫靶編輯事件。然後，我們誘導APOBEC1- YTH或APOBEC1-YTHmut表達，並對大細胞上進行DARTseq，以鑑定m6A位點的轉錄組範圍。

為了識別單細胞中的m6A位點，我們誘導APOBEC1- YTH表達，並通過三個生物複製對10352個細胞進行了基於液滴的scRNA-seq分析 (圖1A，1B)。然後，我們使用Bullseye來識別單個細胞中的m6A位點，並在10352個細胞的3844個RNA中發現了16934個高置信度位點。m6A位點和甲基化RNA的檢測在整個樣本中高度一致，表明scDART-seq方法的可重複性 (圖1C)。單細胞m6A位點表現出與群體水平上識別的位點相似的特徵，包括終止密碼子附近和RAC (R=A/G)共有序列中的強富集 (圖1D)。我們還觀察到，使用scDART-seq識別的甲基化RNA與使用基於抗體的m6A標記的體細胞識別的甲基化RNA之間存在高度重疊。因此，這些數據表明scDART-seq可以在單細胞中識別m6A位點，具有較高的準確性和重現性。

圖1. scDART-seq在單細胞中檢測m6A

為了確保單細胞RNA甲基化頻率的這種可變性不是由於基於液滴的方法覆蓋率低所致，我們還使用SMARTseq2技術進行了scDART-seq，從而實現了高單細胞讀取計數並提高了轉錄物的覆蓋率 (圖2A)。覆蓋率和測序深度的提高使得能夠使用更嚴格的標準來識別m6A位點，我們利用這些標準獲得了1068個細胞中7820個RNA中的120904個高置信度m6A位點的列表。所有高置信度位點的元基因分析顯示m6A樣分布，其特徵是終止密碼子附近的強富集 (圖2B)。在多個隨機選擇的單細胞中觀察到了相似的宏基因譜，表明m6A在單個細胞中的分布與更大群體的分布相一致。

圖2. 高覆蓋率scDART-seq在單細胞中檢測m6A轉錄組範圍

這些發現促使我們探索是否可以更普遍地使用m6A來區分細胞亞群。細胞亞型的識別通常通過使用基於基因表達的聚類來發現基因表達模式的異質性。為了確定mRNA甲基化是否可用於區分細胞亞群，我們使用scDART-seq鑑定的%C2U值對細胞進行聚類。這顯示了兩個不同的集簇 (圖7A)。兩個me-簇之間的APOBEC1-YTH表達、細胞周期分布和全局基因表達模式高度相似，表明這些因素對基於m6A的細胞簇沒有貢獻 (圖7B、7C)。

圖7. 基於m6A的聚類以識別細胞亞群

結論及展望

總之，我們開發了一種單細胞m6A分析方法，並用它來識別11420個單細胞的甲基化組。迄今為止，轉錄組範圍的m6A作圖研究一直受到高輸入RNA要求的阻礙，因此僅限於分析大量細胞中的m6A。scDART-seq規避了這些問題，並且如本文所述，揭示了群體水平的m6A分析研究遺漏的RNA甲基化的基本特徵。我們發現，單細胞在3100個mRNAs中平均包含7000個m6A位點，低於大細胞m6A分析的預測值。與此同時，我們發現單個mRNAs包含的總m6A位點比以前從群體水平m6A作圖中確定的要多得多。我們的數據表明，單細胞和群體水平m6A患病率之間的差異在很大程度上是由單細胞中單個m6A位點頻率的極端異質性驅動的。

原文鏈接

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1097276521011436?via%3Dihub

參考文獻

1.Tegowski Matthew,Flamand Mathieu N,Meyer Kate D,scDART-seq reveals distinct mA signatures and mRNA methylation heterogeneity in single cells.[J] .Mol Cell, 2022, undefined: undefined.

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