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研究背景
糖膠樹 [Alstonia scholaris (L.) R. Br.]，又名燈台樹，鴨腳樹，隸屬於夾竹桃科雞骨常山屬，廣泛分布於東南亞、南亞和亞熱帶地區, 是傳統中成藥燈台葉顆粒、燈台葉片的主要成分。具植物志記載，糖膠樹的根、樹皮、葉均含有生物鹼，供藥用。根皮、樹皮可治頭痛、傷風、肺炎、慢性支氣管炎等。
糖膠樹含有豐富的吲哚生物鹼，akuammilan 類生物鹼是其中一大類具有抗癌、抗菌、抗瘧疾等多種生物活性的單萜吲哚生物鹼，有着獨特的 methanoquinolizidine 籠狀結構， 而且具有 akuammilan 結構的雙吲哚生物鹼擁有成為抗癌新藥的潛力。但是 akuammilan 生物鹼在化學合成上極具挑戰性，在生物合成途徑上也尚未得到解析。
中國科學院分子植物科學卓越創新中心 Evangelos Tatsis 研究團隊基於對糖膠樹轉錄組和基因組挖掘以及生化實驗，第一次解析了產生 akuammilan 生物鹼共有籠狀骨架的關鍵酶，並首次解析了編碼 akuammiline 生物鹼的生物合成過程，利用分子建模和定點突變試驗剖析了兩個關鍵 p450 在合成 akuammilan 生物鹼和 strychnos 生物鹼骨架中的催化機理。

相關工作以題為「Deciphering and Reprogramming the Cyclization Regioselectivity in Bifurcation of Indole Alkaloids Biosynthesis」 的論文發表在英國皇家化學會旗艦期刊 Chemical Science上。

研究內容
據已有的文獻分析，單萜吲哚生物鹼的生物合成都可源於共同的前體 strictosidine，並在 strictosidine glucosidase (SGD)、geissoschizine synthase (GS)的催化下合成 geissoschizine 分子骨架，之後經過不同 P450 酶的催化下，合成不同類型的單萜吲哚類生物鹼。Sarpagan bridge enzyme (SBE) 催化 geissoschizine 的 C5-C16 環化形成 sarpagan 類型生物鹼的基本骨架。geissoschizine oxidase(GO)催化 geissoschizne C2-C3 鍵斷裂，C2-C16，C3-C7 鍵形成，形成 strychnos 類型生物鹼的基本骨架。從結構出發，研究人員推測 akuammilan 類型生物鹼的基本骨架是通過 geissoschizne 的 C7-C16 鍵環化而生成。

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圖 1. 夾竹桃科植物的單萜吲哚類生物鹼的代謝途徑概述。

研究人員首先對糖膠樹的基因組以及轉錄組數據進行組裝，通過分析 akuammiline 和 geissoschizine 的化學結構，挖掘了可能涉及 akuammilan 類生物鹼 rhazimal、rhazimol 和 akuammiline 生物合成的基因，並通過異源表達純化蛋白和酵母共表達系統確認了基因編碼酶的活性。鑑定了催化 geissoschizine 環化重排的 P450 酶RHS, 兩個還原 rhazimal 為 rhazimol 的乙醇脫氫酶 RHR, 兩個合成 akuammiline 的乙酰轉移酶 AKS。
▲ 圖 2. Akuanniline 生物合成的途徑解析。

為了探究同為 P450 酶的 RHS 和 GO，催化 geissoschizine 分別產生 akuammilan 類型和 strychnos 類型單萜吲哚類生物鹼的機理。研究人員對 RHS 和 GO 進行了同源建模和分子對接，找出可能影響底物催化的 5 個氨基酸殘基。通過突變試驗，發現 RHS 第 372 位的 phenylalanine 和 GO 第 372 位 valine 是控制其生物活性的關鍵性位點。推測可能是第 372 位氨基酸側鏈大小的不同改變了底物在活性位點的位置，影響了底物與血紅素的相互作用，從而影響了酶的功能活性。

▲ 圖 3. AsRHS 和 AsGO 分子建模和活性位點突變。

基於分子模型和突變體體外酶活實驗，研究人員提出了 RHS 可能的催化機制。RHS 優先氧化 geissoschizine 的 C7，隨後失去一個水分子，緊接着 C16 親核攻擊 C7 的碳正離子，從而形成了 akuammilan 類型生物鹼的 rhazimal。

▲ 圖 4. 推測的 AsRHS 催化機制。


總結展望
研究者基於夾竹桃科植物單帖吲哚生物鹼的生物合成，首次揭示了控制 akuammilan 生物鹼獨有骨架形成的基因，同時解析了 akuammiline 生物鹼生物合成的完整途徑，為全面解析 akuammilan 家族生物鹼的生物合成奠定了理論基石，也為新藥研發打開了大門。通過蛋白質定點突變在微觀上揭示了不同 p450 在催化上的區域選擇性，為後續蛋白質工程提供了靶向位點。
論文信息

Deciphering and Reprogramming the Cyclization Regioselectivity in Bifurcation of Indole Alkaloids Biosynthesis

Zhuo Wang, Yiren Xiao, Song Wu, Jianghua Chen, Ang Li, Evangelos C. Tatsis*

Chem. Sci., 2022https://doi.org/10.1039/D2SC03612F

作者簡介



王卓博士研究生

中國科學院分子植物科學卓越創新中心

本文第一作者，本科畢業於西北大學生命科學學院生物技術專業，現為中國科學院分子植物科學卓越創新中心 Evangelos Tatsis研究組博士研究生，專注於 akuammilan 生物鹼的生物合成路徑的解析。




肖伊人博士研究生
中國科學院分子植物科學卓越創新中心

本文第一作者，本科畢業於華中農業大學農學院農學專業，現為中國科學院分子植物科學卓越創新中心 Evangelos Tatsis 研究組博士研究生，致力於雞骨常山屬植物的單萜吲哚生物鹼的生物合成路徑的研究。




Evangelos Tatsis 研究員

中國科學院分子植物科學卓越創新中心
本文通訊作者，中國科學院分子植物科學卓越創新中心研究員，課題組組長，獲得國家自然科學基金授予的國際優秀青年科學家(RFIS-II)稱號。2001 年於希臘約阿尼納大學取得化學學士學位，並於約阿尼納大學攻讀博士學位，專業為天然產物化學。獲得瑪麗居里獎學金在德國馬克斯-普朗克化學生態學研究所（德國耶拿）繼續吲哚生物鹼的生物合成研究。後加入英國約翰英納斯中心（英國諾里奇）Sarah O』Connor 教授課題組繼續博士後，致力於吲哚生物鹼生物合成的分子生物學和生物化學方面的研究。並於 2017 年加入分子植物科學卓越創新中心成為課題組組長，該研究團隊同時隸屬於中國科學院與英國約翰·英納斯中心合作共建的國際聯合單元植物和微生物科學聯合研究中心(CEPAMS)。其研究成果先後發表於 Nature Communications, Nature Plants, JACS, Angewandte Chemie, New Phytologist等國際學術期刊上。
Evangelos Tatsis 實驗室歡迎有機合成、天然產物化學、結構生物學、合成生物學和植物生物學背景的學者加入，進行博士或博士後研究。
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Chem. Sci.
2-年影響因子*9.969分5-年影響因子*9.974分最高 JCR 分區*Q1 化學-綜合CiteScore 分†14.7分中位一審周期‡31天


Chemical Science 是涵蓋化學科學各領域的跨學科綜合性期刊，也是英國皇家化學會的旗艦期刊。所發表的論文不僅要在相應的領域內具有重大意義，而且還應能引起化學科學其它領域的讀者的廣泛興趣。所發表的論文應包含重大進展、概念上的創新與進步或者是對領域發展的真知灼見。發文範圍包括但不限於有機化學、無機化學、物理化學、材料科學、納米科學、催化、化學生物學、分析化學、超分子化學、理論化學、計算化學、綠色化學、能源與環境化學等。作為一本鑽石開放獲取的期刊，讀者可以免費獲取所發表論文的全文，同時從該刊的論文版面費由英國皇家化學會承擔，論文作者無需付費。

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Malika Jeffries-EL🇺🇸 波士頓大學




* 2021 Journal Citation Reports (Clarivate,2022)†CiteScore 2021 by Elsevier‡中位數，僅統計進入同行評審階段的稿件


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