鑽石舞台

大家好！今天給大家介紹一篇2021年8月發表在frontiers in Cell and Development Biology（IF：6.684）上的文章。作者對頭頸部鱗狀細胞癌發生復發的患者的轉錄組數據進行分析鑑定與其預後有關的免疫相關基因。

Identification of the Immune-Related Genes in Tumor Microenvironment That Associated With the Recurrence of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

鑑定頭頸部鱗狀細胞癌復發有關的腫瘤免疫微環境中的免疫相關基因

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頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）是最常見的惡性腫瘤之一，具有高度轉移率且預後較差。腫瘤免疫微環境會影響腫瘤的發生，發展和預後，但潛在的機制仍然不是十分清楚。本研究作者描述HNSCC復發和腫瘤微環境（TME）之間的關係。對TCGA數據集的116例患者的表達數據進行ESTIMATE分析評估基質細胞，免疫細胞和預後打分。對DEGs進行富集分析並構建PPI網絡。使用TIMER評估腫瘤免疫細胞豐度並研究HNSCC中腫瘤細胞的浸潤情況。有407個免疫相關基因參與TME，其中CCR5,CD3E,CD4和HLA-DRB1是最顯著的DEG。TME中，樹突狀細胞（DCs）的豐度最高。無監督聚類鑑定到了10類免疫浸潤模式，CD4+ T細胞和B細胞與HNSCC預後有關。總的來說，作者的研究鑑定了頭頸部鱗狀細胞癌預後有關的免疫基因和免疫浸潤細胞，為今後HNSCC的抗腫瘤藥物篩選和耐藥性研究提供基礎。

1. 數據集的獲取和下載

從UCSC數據庫下載TCGA-HNSCC的RNA-seq數據集，共包含116例腫瘤樣本。作者將HNSCC患者進行手術治療後發生新腫瘤的患者定義為復發HNSCC。

2. 免疫打分和基質打分與復發HNSCC病理特徵的相關性

本研究共包含116例HNSCC樣本，65.5%的患者年齡在60歲以上，43.1%的患者存活，65.5%的患者腫瘤分期為Ⅲ/Ⅳ。使用ESTIMATE計算基質打分和免疫打分，KM分析表明基質打分和免疫打分與HNSCC復發患者的預後有關（圖1A和1B）。此外，作者研究基質打分和免疫打分與HNSCC復發患者的年齡，腫瘤分期和治療方法的相關性。結果表明，基質打分和免疫打分與年齡，腫瘤分期相關，而與治療沒有相關性。

圖1 基質打分和免疫打分與患者預後顯著相關

3. 鑑定復發HNSCC患者的免疫相關基因

根據ESTIMATE分析將患者分為免疫打分-高和免疫打分-低組及基質打分-高和基質打分-低組。分別對免疫分組和基質分組進行差異分析鑑定DEGs，聚類熱圖如圖2A和2B所示。免疫打分-高組中有521個上調基因和3個下調基因（圖2C）。基質打分-高組中有648個上調基因和18個下調基因（圖2D）。將兩個基因集取交集有407個重疊基因，可作為免疫相關基因（圖2E）。

圖2 免疫打分和基質打分分組的差異分析

4. 模塊為中心的基因網絡

為鑑定HNSCC中與TME相關的DEGs，作者構建模塊為中心的基因網絡。作者構建了一個包含212個節點和2016條邊的PPI網絡，研究腫瘤預後有關的免疫相關基因的相互作用（圖3A）。MCODE分析鑑定到至少有3個節點的8個模塊（圖3B），其中紅色模塊有29個節點和372條邊，棕色模塊和粉色模塊只有3個節點和3條邊。

圖3 模塊為中心的基因網絡

5. 復發HNSCC免疫相關基因的功能富集分析

為研究407個免疫相關基因的潛在分子機制，作者對這些基因進行功能富集分析。免疫相關基因主要富集於白細胞遷移，免疫應答調節細胞表面受體信號通路和免疫激活細胞表面受體信號通路等BP功能（圖4A），在CC功能上主要富集與細胞外基質等（圖4B），在MF功能上主要富集與抗原結合，細胞外基質結構成分（圖4C）。KEGG富集分析表明，免疫相關基因富集於細胞粘附分析和細胞因子受體相互作用等通路（圖4D）。以上結果表明，免疫相關基因與TME的細胞外基質和細胞互作有關。

圖4 免疫相關基因的功能富集分析

6. 免疫相關基因的生存分析

使用KM分析研究免疫相關基因與復發HNSCC患者的生存情況。結果表明，有206個基因與復發HNSCC患者生存顯著有關。其中OR2I1P、SPOCK2、CCR5、DPT、CD3E、C2、CD4、VCAM1、CD79A、HLA- DRB1、DOK3、TRBC1、RARRES2、AXL和IGKV1-16是最重要的預後因子（圖5）。因此，作者選擇這些基因進行下一步分析。

圖5 KM分析

7. 復發HNSCC TME的免疫情況

樹突狀細胞（DCs）是HNSCC腫瘤微環境中豐度最高的免疫細胞類型（圖6A）。圖6B為免疫細胞浸潤比例。隨後，作者分析不同免疫細胞浸潤比例的相關性（圖6C）。隨後，作者進一步分析了免疫細胞浸潤比例與復發HNSCC生存的相關性。如圖6D所示，簇3的CD4+ T細胞比例較高而B細胞比例較低，簇3與預後較好有關。簇5的CD4+ T細胞和B細胞比例較低，簇5與預後較好有關。以上結果表明免疫細胞浸潤比例與復發HNSCC預後有關。

圖6 復發HNSCC TME的免疫情況

8. 篩選到的免疫相關基因的表達驗證

為鑑定與復發HNSCC TME顯著相關的關鍵基因，作者將PPI網絡中的核心基因與生存分析p值小於0.05的基因取交集，篩選到4個基因，分別為CCR5、CD3E、CD4和HLA-DRB1。對這4個基因進行KM分析，結果表明這4個基因對HNSCC患者生存存在顯著影響（圖6E和6F）。根據免疫細胞浸潤比例對患者進行K-means聚類，共分為10個clusters（圖6G）。隨後，作者研究者4個基因在HNSCC腫瘤組織和癌旁組織中的表達水平。結果表明CCR5、CD3E、CD4和HLA-DRB1在腫瘤組織中的表達水平較高（圖7A-7D）。Western blot結果表明，腫瘤組織中CCR5、CD3E、CD4和HLA-DRB1的蛋白水平較高（圖7E）。免疫組化結果表明CCR5、CD3E、CD4和HLA-DRB1的蛋白表達水平在腫瘤組織中較高（圖7F）。

圖7 免疫相關基因的表達水平驗證

作者基於ESTIMATE算法確定免疫打分分組和基質打分分組，鑑定免疫相關DEGs。通過構建PPI網絡，功能富集分析和KM分析鑑定與預後有關的免疫相關基因。本研究全面研究了復發HNSCC患者的免疫相關基因和腫瘤微環境中的免疫細胞。本研究的亮點在於作者對鑑定到的免疫相關基因進行了實驗驗證但仍需在大量數據集上進行驗證。

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