Cell-Membrane-Derived Nanoparticles with Notch-1Suppressor Delivery Promote Hypoxic Cell–Cell Packingand Inhibit Angiogenesis Acting as a Two-Edged Sword
作者：Hye-Seon Kim, Young Min Shin, Seyong Chung, Dahee Kim, Dan Bi Park, Sewoom Baek, Jeongeun Park, Si Yeong Kim, Dae-Hyun Kim, Se Won Yi, Songhyun Lee, Jung Bok Lee, Ji-Yun Ko, Gun-Il Im, Mi-Lan Kang, Hak-Joon Sung(Department of Medical Engineering, Yonsei University College of Medicine, Seoul, 03722 Republic of Korea).
發表情況:Adv Mater.2021 Oct;33(40):e2101558.doi: 10.1002/adma.202101558.Epub 2021 Aug 25.
當細胞通過緊密的膜-膜接觸而被擠在一個有限的空間時，儘管氧氣供應沒有變化，但不斷增長的細胞群體之間的氧氣消耗競爭卻在增加，導致氧氣耗盡或缺氧。缺氧通常伴隨軟骨發育和癌症進展。間充質幹細胞在含氧量低的團塊培養或低氧條件下可促進軟骨方向分化。在炎症性關節炎進展中，Notch信號通過激活內皮細胞(ECs)誘導血管生成。抑制Notch信號導致軟骨保護作用。除此之外，通過靶向特定基因或受體抑制Notch-1信號介導的腫瘤血管生成，可以抑制腫瘤生長和侵襲，而不產生任何副作用。因此，作者提出實驗假說，通過細胞膜衍生的納米顆粒（CMNP）誘導細胞-細胞堆積，營造低氧環境，結合使用Notch信號抑制劑，可以抑制血管生成，同時達到促進喉癌細胞死亡和軟骨形成的雙重作用。從而提出以前未探索的使用CMNPs進行抗癌和軟骨保護治療的策略。
1. CMNP可有效促進低氧狀態下細胞聚集。
2. CMNP注射誘導的低氧環境可以促進軟骨成熟。
3. Notch-1抑制劑（apt)具有抗癌細胞增殖，抗血管形成，促進軟骨形成作用。
4. 聯合使用CMNP和Notch-1抑制劑可促進抗癌和軟骨形成。
在組織再生和癌症進展中，細胞膜的相互接觸產生細胞-細胞相互作用，可以調節細胞內信號，這表明在研究這些過程中迫切需要使用細胞膜衍生的工具。因此，細胞膜衍生納米顆粒（CMNP）通過兒童扁桃體衍生的間充質幹細胞（TMSC）製造產生，因為這種來源的間充質幹細胞倍增時間短。作為兩種靶細胞類型，喉癌細胞與骨髓來源的骨髓間充質幹細胞（BMSCs）分別代表了軟骨損傷和軟骨生成的特點。用CMNPs處理這些細胞類型的細胞團塊會加劇球體間的缺氧，在7天內表現出明顯的細胞間的相互作用特點。這兩種細胞都喜歡缺氧環境，而血管生成過程則相反，軟骨中缺少血管形成，但這是癌症生長所必需的。因此，通過在CMNP上結合Notch-1適配體來抑制血管生成。通過一系列細胞實驗以及異種移植喉癌小鼠動物模型進行的一系列動物實驗，觀察到喉癌生長被有效抑制，而軟骨生成被促進。總之，CMNPs具有雙重功能，即誘導缺氧細胞堆積，然後抑制血管生成，同時促進喉癌死亡和軟骨生成。這項研究提出了一種以前未經探索的使用CMNPs進行抗癌和軟骨保護治療的治療策略。Cell–cell interactions regulate intracellular signaling via reciprocal contactsof cell membranes in tissue regeneration and cancer growth, indicating acritical need of membrane-derived tools in studying these processes. Hence,cell-membrane-derived nanoparticles (CMNPs) are produced using tonsil derivedmesenchymal stem cells (TMSCs) from children owing to their shortdoubling time. As target cell types, laryngeal cancer cells are comparedto bone-marrow-derived MSCs (BMSCs) because of their cartilage damagingand chondrogenic characteristics, respectively. Treating spheroids of thesecell types with CMNPs exacerbates interspheroid hypoxia with robust maintenanceof the cell–cell interaction signature for 7 days. Both cell types prefera hypoxic environment, as opposed to blood vessel formation that is absentin cartilage but is required for cancer growth. Hence, angiogenesis is inhibitedby displaying the Notch-1 aptamer on CMNPs. Consequently, laryngealcancer growth is suppressed efficiently in contrast to improved chondroprotectionobserved in a series of cell and animal experiments using a xenograftmouse model of laryngeal cancer. Altogether, CMNPs execute a two-edgedsword function of inducing hypoxic cell–cell packing, followed by suppressingangiogenesis to promote laryngeal cancer death and chondrogenesis simultaneously.This study presents a previously unexplored therapeutic strategy foranti-cancer and chondroprotective treatment using CMNPs.
圖一：細胞膜衍生的納米顆粒（CMNP）可有效促進細胞聚集，加劇缺氧狀態。
（a、b）通過一系列孔徑減小的過濾器對TMSCs進行過濾，導致其重複破壞和自組裝CMNPs。得到的CMNPs不再表達間充質幹細胞標誌物CD90，陽性表達外泌體標誌物CD9, CD63, 和CD81。說明獲得了與外泌體性質相似的CMNP。
（c）經過一系列膜重組過程後，細胞間相互作用介質N鈣黏素和E鈣黏素在納米顆粒中仍然表達。儘管N鈣黏素的表達降低了。
（d）用喉癌細胞Hep2和BMSC細胞懸浮培養形成細胞小球，培養液中CNNP，與未加納米顆粒的細胞小球對比。檢測小球內部的缺氧程度。缺氧程度越高，紅色熒光越強。
（f, g）同時，2D培養條件下，細胞增殖速度更快，並表現出更密集重疊的細胞形態。低氧誘導因子HIF1α, E 鈣黏素，N鈣黏素的表達都是CMNP組更高。
圖二：由於CMNPs作為細胞-細胞相互作用的啟動子產生的缺氧效應造成了軟骨保護和癌症存活。
(a -d) 由於關節軟骨暴露在缺氧條件下，軟骨細胞適應低氧環境，從而維持其表型。在手術誘導骨關節炎6周後，通過向大鼠膝關節注射CMNPs來確定缺氧誘導的前軟骨形成效應。試驗組注射20微克每毫升的納米顆粒，Kartogenin (KGN)是一種smad4/smad5通路激活劑,促進多功能間充質幹細胞選擇性分化為軟骨細胞，在此作為陽性對照，PBS組是陰性對照。與陰性對照相比納米顆粒組表現與KGN陽性對照組相似，觀察到清晰的軟骨再生。但是，新生組軟骨質量仍不如與正常軟骨相比，並且低氧通常會誘導血管再生，進而有產生骨關節炎的風險。(e -f)除此之外，作者進一步研究CMNP對腫瘤細胞增殖的影響，發現，CMNP處理可以促進腫瘤細胞增殖速度，並且促進腫瘤幹細胞標誌物CD133，CD44等的表達。可誘導腫瘤幹細胞的出現。
圖三：Notch-1抑制劑（apt)具有抗癌細胞增殖，抗血管形成，促進軟骨形成作用。
（a-b）Notch-1 apt處理黑色素瘤細胞，可抑制細胞增殖。
（b）人臍靜脈內皮細胞培養中，可以看到Notch-1 apt抑制劑抑制血管形成。
（d-e）在軟骨誘導實驗中，與軟骨誘導劑TGFβ聯合使用，可以促進軟骨形成。
圖四：聯合使用細胞膜衍生的納米顆粒（CMNP）和Notch-1抑制劑可促進抗癌和軟骨形成。
作者將細胞膜來源的納米顆粒與Notch-1抑制劑聚乙二醇化，來防止血液蛋白吸附，延長循環時間。圖(c)共聚焦顯微鏡顯示，CMNP_PEG_apt在第1天主要粘附於細胞膜(白色箭頭)，促進細胞與細胞的相互作用，隨後在第7天通過穿透細胞膜到達核膜。（d-f）在軟骨誘導培養基處理後，在第21天檢測每個CMNP試驗組(20 μg mL−1，每3天更換一次培養基)對骨髓間充質幹細胞小球的軟骨保護作用。（g）CMNP_PEG_apt在治療後第3天通過觀察細胞凋亡的基因表達來檢測其對Hep2細胞的抗癌作用。（h-i）Notch-1下游(Hey1和Hes1)標記物和TUNEL+ Hep2細胞(凋亡細胞黃色，細胞骨架綠色，合併細胞核藍色)每個實驗組的抗血管生成作用通過光學成像(左圖)顯示。(j)在基質上培養HUVECs 24h，通過光學成像定量分析血管的總長度和數量。
圖五：聯合使用細胞膜衍生的納米顆粒（CMNP）和Notch-1抑制劑的體內靶向腫瘤和生長抑制作用
接着作者進行體內實驗，在裸鼠皮下移植黑色素瘤細胞，十天後，將各實驗組用熒光染料標記，用PBS做陰性對照，進行腹腔注射，分別在注射後1，4，7，10天進行活體成像觀察，腫瘤移植部位的IVIS成像(b)和熒光強度的定量分析(c)顯示了優越的10天靶向性 CMNP_PEG_apt高於其他測試組，在第1天信號最大，隨後隨時間遞減。（f-j）抗癌作用表現為腫瘤生長的進行性抑制，因為在試驗組中，只有CMNP_PEG_apt治療較對照組顯著減小了腫瘤體積。第28天Notch-1下游(Hey1和Hes1)、凋亡(caspase-3)、增殖(Ki67)和促血管生成(PECAM)標記物的基因表達。採用實時定量pcr對腫瘤標本進行定量分析。第28天檢測Notch-1、增殖(Ki67)、血管生成(CD31)和凋亡(caspase-3)標記蛋白的表達。(i-j)通過western blot， HE染色圖像(黑色箭頭:血管)和免疫組化定量分析腫瘤組織,表現為抗血管生成，抑制細胞增殖。
圖六：聯合使用細胞膜衍生的納米顆粒（CMNP）和Notch-1抑制劑具有抗血管生成作用以及產生內源性缺氧效應。
在裸鼠體內原位異種移植Hep2細胞後，研究了CMNP_PEG_apt對腫瘤生長和軟骨增強的雙重作用。裸鼠在異種移植後21天注射PBS (vehicle)(a)和喉部區域終點分析。在各實驗組中，通過熒光珠灌注散在信號觀察，CMNP_PEG_apt的抗血管生成作用明顯，其形成的血管網絡受到干擾。(c)注射CMNP_PEG_apt通過降低Notch-1和促血管生成(CD31)標記物的表達，有效地誘導了抗癌作用，從而抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡。(d) CMNP_PEG_apt的促軟骨形成作用導致喉部組織的軟骨增強，如圖所示，與其他試驗組相比，表現為蛋白多糖和膠原含量明顯，具有豐富的正常組織樣軟骨結構。本文使用膜源性介質，細胞膜源性納米顆粒(CMNPs)，通過橋接膜-膜接觸來促進細胞-細胞相互作用，發現CMNPs聯合Notch1抑制劑，可以實現抗血管生成，同時達到抗腫瘤細胞生長和促進軟骨形成的雙重作用。
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