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Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation

作者：Hui SophieShu, Yiming Liam Liu, Xinyu Thomas Tang, Xinyi Shirley Zhang, Bin Zhou, Weiguo Zou, Bo O.Zhou(State Key Laboratory of Cell Biology, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China; State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China. )

發表情況：Cell Stem Cell.2021 Sep 6; S1934-5909(21)00347-7. doi: 10.1016/j.stem.2021.08.010.

科學問題

1.青春期前後骨骼祖細胞的轉化機制是什麼？

2.為什么小鼠軟骨內骨骼在青春期後，從快速縱向生長過渡到緩慢的重塑？

重要發現

1.青春期前後的骨形成由不同的祖細胞控制。

2.軟骨細胞和 Lepr+BMSCs 分別介導骨增長和增厚。

3.成人骨骼祖細胞主要來自發育性骨骼祖細胞。

4.跑步是在發育的過程中起到增強成骨作用。

中文摘要

多種不同類型的骨骼祖細胞已被證明有助於軟骨內骨骼的發育和維持。然而，不同祖細胞種群之間的分工和等級關係仍未確定。在這裡，我們開發了雙重組酶命運定位系統來觀察出生後骨形成過程中的骨骼祖細胞轉變。我們發現出生後成骨細胞主要來自青春期前的軟骨細胞和青春期後 Lepr+骨髓基質細胞 (BMSCs)。這種轉變發生在青春期的骨幹中，並逐漸擴散到干骺端。形成成骨細胞的 Lepr+BMSC 主要來源於胎兒 Col2+細胞。從圍產期軟骨細胞和成年 Lepr+BMSCs 條件性敲除Runx2 分別損害了骨骼的增長和增厚。強迫跑步增加了圍產期軟骨細胞的成骨細胞形成但不能促進成年Lepr+BMSCs的成骨細胞形成。因此，短期發育的骨骼祖細胞產生了長期的成人骨骼祖細胞。它們依次控制軟骨內骨骼的生長和維持。

英文摘要

Multiple distinct types of skeletal progenitors have been shown to contribute to endochondral bone development and maintenance. However, the division of labor and hierarchical relationship between different progenitor populations remain undetermined. Here we developed dual-recombinase fate-mapping systems to capture the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. We showed that postnatal osteoblasts arose primarily from chondrocytes before adolescence and from Lepr+bone marrow stromal cells (BMSCs) after adolescence. This transition occurred in the diaphysis during adolescence and progressively spread to the metaphysis. The osteoblast-forming Lepr+BMSCs derived primarily from fetal Col2+cells. Conditional deletion of Runx2from perinatal chondrocytes and adult Lepr+BMSCs impaired bone lengthening and thickening, respectively. Forced running increased osteoblast formation by perinatal chondrocytes but not by adult Lepr+BMSCs. Thus, the short-term developmental skeletal progenitors generated the long-term adult skeletal progenitors. They sequentially control the growth and maintenance of endochondral bones.

結 果

圖 1. 軟骨細胞形成出生後早期骨骼中的大多數成骨細胞，但它們的貢獻在2個月齡時下降。

（A 和 B）來自 AcancreER;R26tdTomato;Col1a1-GFP 小鼠的股骨切片的共聚焦成像。在 P1-P3 接受他莫昔芬處理，在處理後 1 天 (A) 和 1 個月 (B) 對小鼠進行分析。箭頭表示Tomato+骨細胞。 n = 來自 3 個獨立實驗的每種條件 3 只小鼠。

（C 和 D）來自 AcancreER;R26tdTomato;Col1a1-GFP 小鼠的股骨切片的共聚焦成像，在 2 月齡時接受過他莫昔芬處理。在處理後 1 天 (C) 和 2 個月 (D) 對小鼠進行分析。n = 來自 3 個獨立實驗的每種條件 3 只小鼠。

(E 和 H) 使用流式細胞術分析 1 月齡的AcancreER;R26tdTomato;Col1a1-GFP小鼠中酶解分離的股骨幹 (E) 或骨髓細胞 (H) ，這些小鼠在 P1-P3 接受他莫昔芬處理。來自 Col1a1-GFP 小鼠的股骨被設置為陰性對照（灰色峰值）。n = 來自 3 個獨立實驗的 5 只小鼠。

(G和J)流式細胞術分析4月齡AcancreER;R26tdTomato;Col1a1-GFP小鼠經酶解分離的股骨幹(G)或骨髓細胞(J)，這些小鼠在2個月前接受了他莫昔芬處理。3個獨立實驗，n=3隻小鼠。

(K)1 月齡和 2 月齡的 AcancreER;R26tdTomato;Col1a1-GFP小鼠的股骨骨髓的所有 CFU-F 集落的百分比；表示為Tomato。 小鼠在 P1-P3 接受他莫昔芬處理。 n = 來自 3 個獨立實驗的 5 只小鼠。

(l和M)AcancreER;R26tdTomato;Col1a1-GFP小鼠椎骨(L)和頭蓋骨(M)中的Col1a1-GFP+成骨細胞百分比。用流式細胞儀測定數據。所有數據代表3個獨立實驗每個時間點5隻小鼠的平均值±SD。

圖2. Lepr+BMSCs 在成年期形成大部分成骨細胞，但在發育過程中形成的很少。

(A 和 B) Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP 股骨切片的共聚焦成像，P1-P3 接受他莫昔芬處理，在處理後 1 天 (A) 或 2 個月 (B) 對小鼠進行分析。n = 來自 3 個獨立實驗的每種條件 3 只小鼠。

(C 和 D) Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP 股骨切片的共聚焦成像， 2 月齡時接受過他莫昔芬處理。在處理後 1 天 (C) 和 4 個月 (D) 對小鼠進行分析。箭頭表示Tomato+骨細胞。 n = 來自 3 個獨立實驗的每種條件 3 只小鼠。

(E和F)流式細胞術分析2月齡Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠的酶解分離的骨髓細胞，這些小鼠在P1-P3接受他莫昔芬處理(E)或6月齡Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠，這些小鼠在2個月齡時接受他莫昔芬處理(F)。以野生型小鼠骨髓細胞為陰性對照(灰峰)。N=5隻小鼠，每種條件5隻，來自5個獨立的實驗。

(G) 用流式細胞術對2月齡經他莫昔芬處理的所有Lepr+BMSCs在Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠中為Tomato+的百分比進行定量。所有數據代表5個獨立實驗每個時間點5隻小鼠的平均±SD。用重複測量、單因素方差分析、溫室-蓋塞校正和Tukey多重比較檢驗他莫昔芬處理後不同時間點的差異有統計學意義(P<0.05)。

(H 和 I) 流式細胞術分析2月齡Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠在P1-P3接受過他莫昔芬處理(H)或6個月齡Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠在2個月齡時經他莫昔芬處理(I)後酶解分離的股骨的結果。以Col1a1-GFP小鼠股骨為陰性對照(灰峰)。N=5隻小鼠，每種條件5隻，來自5個獨立的實驗。

(J)用流式細胞儀測定2月齡Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠經他莫昔芬處理後，Col1a1-GFP+成骨細胞中Tomato陽性細胞的百分比。所有數據代表5個獨立實驗每個時間點5隻小鼠的平均±SD。用重複測量、溫室-蓋塞校正的單因素方差分析和圖基多重比較檢驗他莫昔芬處理後不同時間點的差異有統計學意義(*p<0.001)。

(K) Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠股骨骨髓中所有 CFU-F 集落的百分比；表示為 Tomato。在他莫昔芬處理後 2 個月對小鼠進行分析。n = 來自 3 個獨立實驗的 5 只小鼠。

(L 和 M)Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠的椎骨 (L) 和顱骨 (M) 中的 Col1a1-GFP+ 成骨細胞的百分比。通過流式細胞術測量數據。所有數據代表來自 3 個獨立實驗的每個時間點 5 只小鼠的平均值± SD。

圖3. 成年 Lepr+BMSCs，而不是圍產期軟骨細胞，有助於骨折癒合。

(A) 正常小鼠或骨折後 2 或 8 周小鼠股骨切片的番紅 O 染色。n = 來自 3 個獨立實驗的每種條件 3 只小鼠。

(B-D) 來自 AcancreER;R26tdTomato;Col1a1-GFP小鼠骨折後 2 周（B 和 C）或 8 周（D）的股骨切片的共聚焦成像。小鼠在骨折後（B）或 P1-P3（C 和 D）接受他莫昔芬處理。 n = 來自 3 個獨立實驗的每種條件 3 只小鼠。

(E 和 F) Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠骨折後 2 周 (E) 或 8 周 (F)股骨切片的共聚焦成像。小鼠在 2 個月大時接受他莫昔芬處理，並在 4 個月大時骨折造模。 n = 來自 3 個獨立實驗的每種條件 3 只小鼠。

圖4. 軟骨細胞、Lepr+BMSCs及其骨系之間的分級。

(A) 示意圖顯示了同時追蹤軟骨細胞和 Lepr+BMSCs 的方法。

(B) 10 周齡Col2-cre; LeprdreER; R26LSL-ZsGreen; R26RSR-tdTomato小鼠的股骨切片的共聚焦成像，小鼠在 4 周齡和 7 周齡時接受他莫昔芬處理。 Col2 和 Lepr 衍生的細胞分別用 ZsGreen 和 Tomato 標記。成骨細胞通過抗 Osx 染色進行標記。n = 來自 3 個獨立實驗的 3 只小鼠。

(C)對在4 周齡和 7 周齡時接受他莫昔芬處理後的10 周齡 Col2-cre; LeprdreER; R26LSL-ZsGreen; R26RSR-tdTomato小鼠酶解分離的骨髓細胞進行流式細胞術分析。來自 Col2-cre; R26LSL-ZsGreen和LeprdreER; R26RSR-tdTomato小鼠的骨髓細胞被設置為陰性對照（灰色峰）。 n = 來自 3 個獨立實驗的 3 只小鼠。

(D) 示意圖表示了對軟骨細胞和 Lepr+BMSCs 進行互斥追蹤的方法。

(E-G) 5 月齡Col2dre; IR (E)，Leprcre; IR (F)和Col2dre；Leprcre; IR 小鼠 (G)的全骨髓細胞的流式細胞術分析。n = 來自 3 個獨立實驗的每個基因型 3 只小鼠。

(H-J) 5 月齡Col2dre; IR (H)，Leprcre; IR (I)和Col2dre；Leprcre; IR 小鼠 (J) 股骨切片的共聚焦成像。成骨細胞通過抗 Osx 染色進行標記。n = 來自 3 個獨立實驗的每個基因型 3 只小鼠。

圖5. 軟骨細胞和 Lepr+BMSCs在青春期產生空間分離的成骨細胞亞群。

(A) 2 月齡的 AcancreER; LeprdreER; R26LSL-ZsGreen; R26RSR-tdTomato小鼠的股骨切片的共聚焦成像，小鼠已在 P1-P3 接受他莫昔芬處理。 n = 來自 3 個獨立實驗的 3 只小鼠。

(B 和 C) 10 周齡的AcancreER; LeprdreER; R26LSL-ZsGreen; R26RSR-tdTomato小鼠的股骨切片的共聚焦成像，小鼠在出生後 P1-P3 和 4 周和 7 周接受他莫昔芬處理。白色虛線人為地將干骺端與骨幹 (B) 分開。Acan 和 Lepr 衍生的細胞分別用 ZsGreen 和 Tomato 標記。成骨細胞通過抗 Osx 染色進行標記。Tomato+:ZsGreen+成骨細胞數量的比率被量化 (C)。n = 來自 3 個獨立實驗的 3 只小鼠。

(D 和 E) 來自 10 周齡 AcancreER; LeprdreER; R26LSL-ZsGreen; R26RSR-tdTomato小鼠的酶解骨髓細胞的流式細胞術分析，小鼠在 P1-P3 以及出生後 4 周和 7 周接受他莫昔芬治療。n = 來自 3 個獨立實驗的 3 只小鼠。

(F) 描述出生後骨骼生長過程中祖細胞轉變的示意圖。圍產期軟骨細胞和 Lepr+BMSCs 對成骨細胞形成的貢獻在時間和空間上是分開的。

圖6. 從圍產期軟骨細胞和成年 Lepr+BMSCs 中敲除Runx2 分別損害骨增長和增厚。

在不同的實驗中檢查了不同的性別，因此大多數數據可以反映了雄性和雌性小鼠的情況。雙尾學生 t 檢驗用於評估性別匹配同窩仔之間差異的統計顯着性（*p < 0.05，* *p < 0.01，* * *p < 0.001）。

(A 和 B) Runx2fl/fl(對照) 和 AcancreER; Runx2fl/fl（突變）小鼠的代表性圖像 (A)及其股骨圖像(B)；在 P1–P3 處接受他莫昔芬處理的 Runx2fl/fl小鼠。 n = 來自 5 個獨立實驗的 5 只小鼠。

(C 和 D) 來自2月齡的 Runx2fl/fl (Con) 和 AcancreER;Runx2fl/fl(突變) 的小梁骨 (C) 和皮質骨 (D) 的代表性顯微 CT 圖像，小鼠在 P1-P3 接受他莫昔芬處理。 n = 來自 5 個獨立實驗的 5 只小鼠。

(E–L) 2月齡Runx2fl/fl(對照) 和 AcancreER; Runx2fl/fl（突變）小鼠股骨的長度 (E)、骨小梁體積/總骨體積 (Tb. BV/TV; F)、骨小梁數量 (Tb. N; G)、厚度 (Tb. Th; H)、間距 (Tb . Sp; I)、皮質面積 (Ct. Ar; J)、皮質面積/總面積 (Ct. Ar/Tt. Ar; K) 和厚度 (Ct. Th; L)。所有數據代表來自 5 個獨立實驗的每個基因型 5 只小鼠的平均值 ± SD。

(M 和 N) 2月齡的 Runx2fl/fl (Con) 和 Leprcre; Runx2fl/fl小鼠的代表性圖像(M) 及其股骨圖像(N)。n = 來自 5 個獨立實驗的 5 只小鼠。

(O 和 P) 2月齡的 Runx2fl/fl(Con) 和 Leprcre; Runx2fl/fl小鼠的小梁骨(O)和皮質骨 (P) 的代表性顯微 CT 圖像。n = 來自 5 個獨立實驗的 5 只小鼠。

(Q–X) 2月齡的 Runx2fl/fl (Con) 和 Leprcre; Runx2fl/fl小鼠的股骨的長度 (Q)，Tb. BV/TV (R), Tb. N(S)，Tb. Th(T)，Tb. Sp (U), Ct. Ar (V), Ct. Ar/Tt. Ar (W)和Ct. Th (X)。所有數據代表來自 5 個獨立實驗的每個基因型 5 只小鼠的平均值 ± SD。

(Y 和 Z) 4 月齡的 Runx2fl/fl(Con)和Leprcre; Runx2fl/fl(Mut)小鼠的代表性圖像(Y) 及其股骨圖像(Z)。n = 來自 5 個獨立實驗的 5 只小鼠。

(AA 和 AB) 4月齡的 Runx2fl/fl(Con) 和 Leprcre; Runx2fl/fl小鼠的小梁 (AA) 和皮質骨 (AB)代表性顯微 CT 圖像。n = 來自 5 個獨立實驗的 5 只小鼠。

(AC–AJ) 4月齡Runx2fl/fl(Con) 和 Leprcre; Runx2fl/f小鼠的股骨長度 (AC)，Tb.BV/TV (AD), Tb. N (AE), Tb. Th (AF), Tb. Sp (AG), Ct. Ar (AH), Ct. Ar/Tt. Ar (AI) 和 Ct. Th (AJ)。所有數據代表來自 5 個獨立實驗的每個基因型 5 只小鼠的平均值 ± SD。

圖7. 強迫跑步顯着增加圍產期軟骨細胞的成骨細胞形成，而對成年 Lepr+BMSCs無明顯促成骨作用。

(A) AcancreER;R26tdTomato;Col1a1-GFP 小鼠實驗時間表示意圖。

(B-D) 使用流式細胞術分析強迫跑步（C）或不跑步（B）的AcancreER;R26tdTomato;Col1a1-GFP小鼠股骨的Col1a1 GFP+成骨細胞（Tomato+成骨細胞）的百分比。數據代表來自 5 次獨立實驗的每種條件下 5 只小鼠的平均值 ± SD。雙尾學生 t 檢驗用於評估差異的統計顯着性（**p < 0.01）。

(E 和 F）來自AcancreER;R26tdTomato;Col1a1-GFP小鼠跑步（F）或不跑步組（E）的股骨切片的共聚焦成像。n = 來自 3 個獨立實驗的每種條件 3 只小鼠。

(G) 顯示 Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠實驗時間表的示意圖。

(H-J)流式細胞術分析 Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠跑步組（I）或不跑步組（H）股骨的Col1a1 GFP+成骨細胞（Tomato+成骨細胞）的百分比。數據代表來自 5 次獨立實驗的每種條件下 5 只小鼠的平均值 ± SD。雙尾學生 t 檢驗用於評估差異的統計顯着性。

(K 和 L) 跑步組(L) 或不跑步組(K)的Lepr-creER; R26tdTomato; Col1a1-GFP小鼠的股骨切片的共聚焦成像。 n = 來自 3 個獨立實驗的每種條件 3 只小鼠。

總 結

作者發現軟骨細胞和骨髓基質幹細胞產生成骨細胞是時間上和空間上分開的，青春期以前的成骨細胞主要來源於Acan+軟骨細胞，而青春期以後的成骨細胞主要來源於Lepr+基質細胞。他們分別參與維持了骨骼的增長和增厚。並且堅持跑步可以促進青春期以前的骨發育。