隨着世界人口年齡中位數的增加，骨骼修復和再生的需求呈急劇上升的趨勢。但傳統的骨移植治療方式仍存在獲取難和供體有限等問題。人骨髓間充質幹細胞(HMSC)是應用於骨組織工程的主要細胞來源之一。優良的組織工程支架則是促進成骨的另一關鍵。來自匹茲堡大學的段崇智院士和林航教授團隊開發了一種可以增強BMP-Smad1/5信號通路的氧化石墨烯功能化納米複合材料。研究員們將氧化石墨烯(GO)基納米片材引入GelMA來進一步增強hMSC的成骨能力。體外實驗證明包裹在新開發的納米複合材料中的hMSC具有較高的存活率和代謝活性。同時GO的摻入顯著增加了hMSC內的礦化，為了進一步增加礦化程度，用二氧化硅包裹的石墨烯氧化物(SiGO)取代GO。機制上來說，納米片增強了內源性骨形態發生蛋白(BMP)的產生、維持和生物活性，從而在沒有外源性骨誘導生長因子的情況下發揮強大的成骨能力。
透射電鏡下，GO呈光滑的織物樣形態，而SiGO呈波浪狀且較厚。GO和SiGO之間的形貌差異在AFM顯微照片中清晰可見。AFM成像記錄的高度剖面顯示，GO的片厚為1.3 nm，SiGO的片厚為46 nm。在GO和SiGO納米片上觀察到了D帶和G帶，這兩個帶分別是石墨材料特徵和結構缺陷的指示。在XPS掃描光譜中，還觀察到了Si2p和Si2s峰，這表明成功地製備了二氧化硅塗層。熱重分析曲線顯示，當從室溫加熱到750℃時，GO的重量顯著下降。
研究人員發現GO或SiGO包埋顯著促進hMSC的礦物質沉積，將hMSC包裹在GelMA、GO/GelMA或SiGO/GelMA中培養28天後，茜素紅、Von Kossa和鈣黃素染色顯示兩種納米複合支架組的礦化明顯增加，且SiGO/GelMA組中鈣磷礦物含量最高、礦化最均勻，在GelMA組沒有觀察到陽性染色（圖3）。RT-qPCR結果顯示，在GelMA中摻入SiGO後上調了兩個主要的成骨標記基因OCN和BMP2的表達。在IHC實驗中，觀察到兩種納米複合材料中的OCN、ALP和COL1蛋白水平明顯高於GelMA組，且三種蛋白在SiGO/GelMA組中的表達最高（圖4）。
為了探究GO和SiGO功能化水凝膠增強內源性BMP2的產生、保持和信號活性。首先檢測了BMP2的表達，免疫熒光圖像顯示BMP2在含有SiGO和GO的樣本中普遍存在。而在GelMA樣品中幾乎沒有發現陽性染色。此外，在BMP信號轉導的下游介質pSMAD1/5的表達方面也觀察到了類似的趨勢（圖5）。研究員發現抑制BMP信號會降低GO和SiGO納米片的骨誘導潛能，t骨形態發生蛋白拮抗劑LDN-193189通過抑制I型BMP受體來阻斷BMP誘導的Smad1/5磷酸化。在LDN處理7天後，GO/GelMA和SiGO/GelMA的pSMAD1/5蛋白水平顯著低於DMSO處理組。LDN處理28天後，茜素紅染色顯示GO/GelMA和SiGO/GelMA的礦化程度都明顯低於DMSO處理組。同時，在所有樣品中都普遍檢測到BMP2，DMSO和LDN處理組之間沒有明顯差異，這表明LDN處理不會削弱納米片誘導BMP2產生的能力（圖6）。
基於此，研究人員提出了一種「納米水庫」機制，用於基於 GO 的納米片在 hMSC 上的成骨增強活性。BMP對納米片的適度結合親和力能夠吸附和釋放細胞產生的內源性 BMP，建立動態沉積-釋放過程並減少BMP向培養基中的損失。釋放的BMP可以部分結合相鄰細胞的BMP配體，證明積極的「反饋迴路」可以增強成骨作用（圖7）。
在小鼠皮下植入模型對納米片狀結構成骨能力進行評估。支架在OM中體外培養21天後，將負載細胞的支架植入。4周後，μCT顯示含有納米複合材料的植入物的骨形成明顯多於GelMA對照組。具體地說，GO/GelMA和SiGO/GelMA的摻入分別導致骨體積的顯著增加。此外，研究還發現納米複合材料中的骨密度(BMD)明顯高於GelMA支架中的骨密度。茜素紅組織學染色也證實了納米複合材料中的礦化水平明顯高於凝膠中的礦化水平。GO和SiGO功能化支架中OCN和ALP水平較高，這意味着成骨能力增強（圖8）。
綜上所述，GO和SiGO納米片在3D GelMA支架中的摻入顯著提升了其包裹的hMSC在體外和體內的成骨能力。這些2D納米材料作為「BMP儲存庫」，能夠有效地吸附和釋放內源性BMP2和BMP7，並通過提高Smad1/5的活性促進成骨。此外，GO的骨誘導作用通過二氧化硅塗層的表面功能化被有效放大，在小鼠皮下植入模型中形成更大的骨體積。從研究BMP和GO納米材料之間的相互作用中獲得的知識應該有助於揭示在三維、細胞負載的納米複合支架中在生物分子水平上各種細胞-納米材料相互作用的機制。
本研究由來自匹茲堡大學的段崇智院士和林航教授團隊完成，並在2021年10月發表於Biomaterials。
文獻信息：Zhong Li, Shiqi Xiang, Zixuan Lin, Eileen N. Li, Haruyo Yagi, Guorui Cao, Lauren Yocum, La Li, Tingjun Hao, Katherine K. Bruce, Madalyn R. Fritch, Huanlong Hu, Bing Wang, Peter G. Alexander, Khiam Aik Khor, Rocky S. Tuan*, Hang Lin*. Graphene oxide-functionalized nanocomposites promote osteogenesis of human mesenchymal stem cells via enhancement of BMP-SMAD1/5 signaling pathway, Biomaterials 2021,121082.
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